张旭东1 刘 鑫1 牛文博1 王 娇1 于恒智1 王 耀2

关键词 吖啶黄素；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌

An Applied Study of Modified Baird-Parker Agar by

Acridine Flavin in the Detection of Staphylococcus Aureus

ZHANG Xu-Dong1 LIU Xin2 NIU Wen-Bo1 WANG Jiao1 YU Heng-Zhi1 WANG Yao2

Abstract In view of the influence of Staphylococcus epidermidis in the detection of Staphylococcus aureus, Baird-Parker Agar was modified to inhibit the growth of Staphylococcus epidermidis and improve the detection efficiency of Staphylococcus aureus. According to the drug sensitivity test of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus, the specificity antibiotic was added to Baird-Parker Agar. Acridine flavin presented obvious specificity in drug sensitivity test. The concentration of acridine flavin in Baird-Parker Agar reached 3.0×10-3 mg/mL could inhibit the growth of Staphylococcus epidermidis and improved the detection efficiency of Staphylococcus aureus.

Keywords acridine flavin; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）革兰氏染色阳性，属于微球菌科，葡萄球菌属，直径为0.8～1.0 μm，细胞单个、成对和多于一个平面分裂成不规则的堆团。《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版），按葡萄球菌属的生理生化组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）3种^[1]。其中表皮葡萄球菌偶尔致病^[2]，腐生葡萄球菌一般为非致病菌，金黄色葡萄球菌由于可以产生肠毒素，能够引起食物中毒，是一种致病性细菌，因此，检测食品中金黄色葡萄球菌具有重要的现实意义^[3]。

具有溶血特性的表皮葡萄球菌对金黄色葡萄球菌的检测形成明显干扰，该类表皮葡萄球菌革兰氏染色阳性，在血平板上形成圆形、光滑凸起、湿润、黄白色菌落，菌落周围可见溶血环；在Baird-Parker琼脂平板上，菌落直径为2～3 mm，黑色，边缘整齐，圆形，凸起湿润，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈^[4]。分离琼脂平板上的菌落特征与金黄色葡萄球菌基本相同，对金黄色葡萄球菌的定性检测造成影响。本研究通过药敏试验选择合适的抗生素吖啶黄素添加Baird-Parker琼脂，在不影响金黄色葡萄球菌生长的情况下，抑制表皮葡萄球菌的生长，从而降低表皮葡萄球菌对金黄色葡萄球菌定性检测的干扰影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金黄色葡萄球菌ATCC49444，表皮葡萄球菌（样品中分离，全自动细菌鉴定系统鉴定）。

1.1.2 主要试剂

7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂、营养琼脂、BHI肉汤、血浆凝固酶，革兰氏染色液、新生霉素、复达新、抗生素溶液、萘啶酮酸、多粘菌素B、吖啶黄素，均购于北京陆桥技术股份有限公司。

利福平（5 μg/片）、阿奇霉素（15 μg/片）、复方新诺明（23.75/1.25 μg/片）、青霉素G（10 μg/片）、苯唑西林（1 μg/片）、头孢唑啉（30 μg/片）、阿米卡星（30 μg/片）、红霉素（15 μg/片）、头孢噻肟（30 μg/片）、环丙沙星（5 μg/片）、万古霉素（30 μg/片）、头孢噻吩（30 μg/片）、庆大霉素（10 μg/片），均购于杭州天和微生物试剂有限公司。

革兰氏阳性细菌鉴定测试板，购于美国BD公司。

1.1.3 主要仪器

高压蒸气灭菌器CL-40M，日本ALP；生物安全柜NUAIRE-425，美国NUAIRE；全自动细菌鉴定系统 Phoenix 100，美国BD；比浊仪 Crystal spec，美国BD；生物电子显微镜BX51，日本OLYMPUS；数码相机E410，日本OLYMPUS；电热恒温培养箱DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗；pH计PB-10，赛多利斯。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌定性检测方法

混匀样品，取有代表性样品25 g（mL），加入225 mL 7.5%氯化钠肉汤，36℃恒温培养18～24 h，接种Baird-Parker琼脂平板和血平板，36℃恒温培养，其中Baird-Parker琼脂平板培养45～48 h，血平板培养18～24 h，观察血平板上的溶血情况，金黄色葡萄球菌在血平板上能够形成透明溶血环；观察Baird-Parker琼脂平板上的菌落特征，金黄色葡萄球菌能够形成菌落直径为2～3 mm，呈灰色或黑色菌落，边缘为淡色，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈。选择特征菌落进行革兰氏染色观察和血浆凝固酶试验，根据革兰氏染色结果、血平板溶血情况和血浆凝固酶试验结果进行分析，然后出具实验报告。

1.2.2 药敏试验

金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，选择不同类别抗生素共计19种^[5-6]。将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的纯培养物配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，用灭菌棉签均匀、全面地涂布平板，使用无菌镊子将药敏纸片放入琼脂平板上的指定位置，36℃培养18～24 h。在培养过程中，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度逐渐降低，在纸片的周围形成浓度梯度从而在纸片的周围形成抑菌圈，使用测量工具测量抑菌圈直径。

1.2.3 抗生素添加剂量试验

配制吖啶黄素3.0 mg/mL，在5 mL 7.5% NaCl肉汤管中分别接种1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、50 μL、100 μL，以形成吖啶黄素在7.5%氯化钠肉汤中的浓度梯度，将纯化的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌制备菌悬液，使用比浊仪测量麦氏浊度值，稀释混匀使每100 μL稀释液约含有金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌10～50个，分别接种各不同吖啶黄素含量的培养管。36℃培养24 h后观察浊度的变化情况，分析不同吖啶黄素浓度对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生长繁殖的抑制情况，以及对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长繁殖影响情况，从而确立吖啶黄素作为抗生素添加物的添加剂量。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 药敏试验结果

金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌涂布营养琼脂平板，使用无菌镊子将13种商用药敏纸片和6种实验室自制药敏纸片放在指定位置，培养后的抑菌圈见图1、图2。

2.1.2 测量抑菌圈直径结果

使用测量工具测量金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径，具体结果见表1。

2.1.3 目标菌在不同浓度吖啶黄素增菌液中的生长情况

金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在含有不同浓度吖啶黄素的7.5%氯化钠肉汤中的生长情况见表2。

2.1.4 目标菌在Baird-Parker琼脂改良前后的对照生长情况

将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌接种Baird-Parker琼脂和改良Baird-Parker琼脂，培养后的生长情况见图3。

a. 金黄色葡萄球菌商用药敏纸片试验结果

b. 表皮葡萄球菌商用药敏纸片试验结果

图1 金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在商用药敏纸片上的试验结果

Fig.1 The experimental results of commercial drug sensitive slips of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis

a. 金黄色葡萄球菌 b. 表皮葡萄球菌

图2 金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在自制药敏纸片上的试验结果

Fig.2 The experimental results of homemade drug sensitive slips of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis

2.2 分析

根据抗生素纸片药物敏感试验结果，大部分的抗生素对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有明显的抑制作用。医用常见抗生素通常对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌同时进行抑制，只有少数的药物敏感菌种例外。选择食品微生物检测过程中常用的抗生素添加物进行纸片扩散实验，发现吖啶黄素能够抑制表皮葡萄球菌的生长，而对金黄色葡萄球菌的生长抑制较弱，即吖啶黄素在表皮葡萄球菌上的抑菌环明显大于金黄色葡萄球菌的抑菌环。

通过研究不同浓度吖啶黄素对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌增菌培养过程中生长繁殖的抑制情况，确定浓度为3.0×10^-3 mg/mL吖啶黄素添加量最为合适。在Baird-Parker分离琼脂平板上，由于吖啶黄素的加入，表皮葡萄球菌的生长明显受到抑制，金黄色葡萄球菌能够正常的生长繁殖且菌落特征典型，符合标准的描述。当Baird-Parker琼脂中吖啶黄素浓度达到3.0×10^-3 mg/mL时，表皮葡萄球菌的生长繁殖明显受到抑制，不能够在琼脂平板上形成菌落，金黄色葡萄球菌能够正常生长繁殖且菌落特征典型，并且吖啶黄素的加入不会改变Baird-Parker琼脂中的营养成分，且不会造成任何影响。

3 讨论

通过对参考文献和资料的分析，很多微生物在生长繁殖过程中不断进化成长，细菌耐药性问题有愈演愈烈的趋势^[7]，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌耐药性的研究，使我们清楚地了解到某种抗生素只是在一定时期能够起到很好的作用。细菌耐药性的存在使抗生素的研发需不断地向前推进，目前已经发现很多的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的耐药菌株，特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌^[8]。

本研究中渗透屏障可能是金黄色葡萄球菌对吖啶黄素耐药的一种机制，细胞壁的增厚是金黄色葡萄球菌对吖啶黄素耐药的一个重要原因^[9]，考虑到表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌相似的细胞壁组成和结构，金黄色葡萄球菌细胞壁特有成分葡萄球菌A蛋白可能是金黄色葡萄球菌对吖啶黄素耐药的一种因素。为方便检测过程中金黄色葡萄球菌的分离和观察，科研人员对Baird-Parker琼脂进行了很多的研究和改进，其中有将Baird-Parker琼脂与血浆凝固酶试验结合的改良方法等^[10]，本研究采用添加吖啶黄素的方法，改进Baird-Parker琼脂，抑制表皮葡萄球菌的生长，提高金黄色葡萄球菌的检测效率。

4 结论

食品中金黄色葡萄球菌的检验原则就是尽最大可能提高检出率，所以检测工作者在日常检测中会从Baird-Parker琼脂平板上多选取典型可疑菌落，以保证不出现漏检情况。抗生素的选择以满足不影响金黄色葡萄球菌的生长，最大限度地抑制表皮葡萄球菌及其他细菌的生长繁殖为宜。对比实验结果表明：吖啶黄素在药敏试验中具有明显的特异性；Baird-Parker琼脂中吖啶黄素浓度为3.0×10^-3 mg/mL时，能够有效地抑制表皮葡萄球菌的生长，进而提高了金黄色葡萄球菌的检测效率。

参考文献

[1]布坎南(R.E.Buchanan)等编. 中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京: 科学出版社, 1984: 667-674.

[2]曾工博,周燕,王温琪,等.公共场所物体表面葡萄球菌分布及耐药性调查[J].中国微生态学杂志, 2018, 30(1): 22-26.

[3]王璇,王娉,葛毅强,等.食品中金黄色葡萄球菌致病性研究进展[J].中国人兽共患病学报, 2017, 33(6): 553-558. 

[4]国家卫生和计划生育委员会, 国家食品药品监督管理总局. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验: GB 4789.10-2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.

[5]曹蕴, 李家斌. 130例表皮葡萄球菌临床分离株的耐药性分析和mecA/icaA/icaD基因研究[J]. 中国抗生素杂志, 2014, 39(9): 683-687．

[6]丛萌倩. 金黄色葡萄球菌耐药性分布特征及分子流行病学研究[J]. 国际检验医学杂志, 2020, 41(11): 1382-1386．

[7]王芳. 2019-2020年昆明某医院细菌耐药性监测[J].检验医学与临床, 2021, 18(23): 3465-3468.

[8]曾江,邹燕,刘滨. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的临床分布及耐药性分析[J].医学信息, 2019, 32(2): 148-149.

[9]李文赟.细胞壁的厚度可能是MRSA对吖啶黄素的耐药机制[J].国外医药(抗生素分册), 2009, 30(3): 144.

[10]容艳芬,李艳嫦,卢勉飞,等.兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术与Baird-Parker琼脂培养基技术检测食品中金黄色葡萄球菌的比较[J]. 中国卫生检验杂志, 2017, 27(5): 642-645.

第一作者：张旭东（1982—），男，回族，辽宁锦州人，本科，高级工程师，主要从事食品检测，E-mail: zhangxudong1103@163.com

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