王 渊1 刘永杰1 金子懿1 王文博1 付 强1 王 爽2 高 毅2

关键词 美洲锥虫；非洲锥虫；双重实时荧光 PCR

Establishment of a Duplex Fluorescence RT-PCR Assay

for Detecting two Trypanosomatid

WANG Yuan1 LIU Yong-Jie1 JIN Zi-Yi1 WANG Wen-Bo1 FU Qiang1 WANG Shuang2 GAO Yi2

Abstract Conservation and specificity of the genomes of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei were compared. Specific primers and probes were designed for nucleic acid detection of these two species. The probes for Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei were labeled by HEX and FAM fluorophore respectively. To establish a duplex fluorescence RT-PCR assay for detecting Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei. Meanwhile, the sensitivity, specificity and reproducibility of duplex fluorescence RT-PCR assay were also analyzed. The result was that the specificity of the method was high on detection the nucleic acid of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei genomes. There were no cross reactions with healthy human blood, healthy human urine, positive control samples of leptospirosis and filariasis. Detection sensitivities of two sets of primers and probes can reach a minimum of 10-4 copies/mL. Duplicate detections for ten times had better repeatability at two dilutions of positive control DNA templates of American trypanosomiasis and African trypanosomiasis. The conclusion was that the duplex fluorescence RT-PCR assay for detecting Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei genomes was highly sensitive, specific and repeatable. It can be used for early detection and typing identification of imported trypanosomiasis cases.

Keywords Trypanosoma cruzi; Trypanosoma brucei; Duplex fluorescence RT-PCR

危害人类的锥虫病（Trypanosomiasis）主要包括美洲锥虫病（American trypanosomiasis）和非洲锥虫病（African trypanosomiasis），是被WHO 列为重点防治的寄生虫病之一^[1-2]。这两种锥虫病的传染源都是由相应的锥虫引起，其中美洲锥虫病是通过感染美洲锥虫，也称克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的锥蝽粪便引起，也可偶然通过被污染的食物、输血、纵向传播、器官移植或实验室等方式造成感染^[3-4]，发病期可分为急性期、隐匿期和慢性期，急性期可引起心脏、消化道和外周神经系统改变。非洲锥虫病是通过感染非洲锥虫，也称布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的采采蝇叮咬传播引起，主要有冈比亚锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）和罗得西亚锥虫（Trypanosoma brucei rhodesiense）2个亚种^[5-6]。非洲锥虫病一般可分为2个发病阶段：第1阶段称血淋巴阶段（haemolymphatic phase），常伴有发热、头痛、关节痛及瘙痒等症状；第2阶段称中枢神经阶段（neurological phase），锥虫可通过血脑屏障进入中枢神经系统，病症有行为改变、感觉障碍及共济失调等，常伴有睡眠周期紊乱^[7]。目前，锥虫病的诊断方法主要有涂片染色观察法、PCR检测法和基因芯片法^[8-11]，存在检测时间长、无法同时检测两种锥虫等缺点，目前尚没有锥虫检测通用的荧光定量PCR检测方法报道。本研究建立了这两种锥虫的双重实时荧光PCR检测方法，可用于输入性锥虫病的早期治疗和分型鉴别。

1 材料和方法

1.1 材料

美洲锥虫和非洲锥虫阳性对照质粒委托上海之江生物公司合成并提供（合成方法见1.2.3）。健康人血液、尿液由陕西国际旅行卫生保健中心提供，钩端螺旋体、丝虫阳性对照样本由上海之江生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

基因组DNA提取采用Qiagen公司核酸提取试剂盒（QIAmp DNA mini Kit），按说明书操作，最后用50 μL洗脱液溶解DNA，-70℃保存。

1.2.2 引物和探针设计

分析了美洲锥虫（GenBank：AJ009148.1）和非洲锥虫（GenBank：AJ009141.1）的基因组序列^[7]，分别设计非洲锥虫和美洲锥虫特异性引物和探针，用于双重实时荧光PCR方法的检测。具体序列见表1和表2，该系列引物和探针序列已申请发明专利（ZL：CN 110295244 A）。

表1 美洲锥虫荧光PCR检测引物和探针

Table 1 Primers and probes for fluorescent PCR detection of Trypanosoma cruzi

表2 非洲锥虫荧光PCR检测引物和探针

Table 2 Primers and probes for fluorescent PCR detection of Trypanosoma brucei

1.2.3 阳性对照

分别合成美洲锥虫（GenBank：AJ009148.1）和非洲锥虫（GenBank：AJ009141.1）上下游引物之间（表1和表2）的DNA片段并克隆至pUC57 载体上。构建成美洲锥虫和非洲锥虫阳性对照质粒，浓度为1.0拷贝/mL，并按10倍进行梯度稀释。

1.2.4 双重实时荧光PCR检测

检测条件 37℃ 20 min，一个循环；94℃ 2 min，一个循环；然后按93℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；在60℃退火/延伸时收集荧光信号。

检测体系 40 μL，包括10×PCR 缓冲液5 μL、MgCl₂（25 mmol/L） 4 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、引物（20 mol/L）0.4 μL/条、探针（20 μmol/L）0.2 μL/条、Taq酶（5 U/L）0.4 μL、模板4 μL、无RNA 酶水25 μL。

1.2.5 特异性评估

分别提取锥虫（美洲锥虫和非洲锥虫各1份）、钩端螺旋体（2份）、丝虫（2份）、健康人血液（2份）、健康人尿液（2份）的核酸作为模板，对建立的方法进行特异性评估。每个样本重复3次。

1.3 结果分析

在实验结果有效情况下，如待测样品有明显扩增曲线，且Ct值≤38，初步判断为阳性，可报告为“检出锥虫特异性核酸（荧光PCR法）”；如待测样品无扩增曲线，初步判断为阴性，可报告为“未检出锥虫特异性核酸（荧光PCR法）”；如待测样品有明显扩增曲线，但38＜Ct值≤40，该样品应重做，重做后仍可出现明显扩增曲线，则判断为阳性，否则为阴性。

待检样本的检测结果如与已知样本的检测结果相一致，则判为真阳性（TP）或真阴性（TN）。如果与已知样本的检测结果不一致，则判为假阳性（FP）或假阴性（FN）。

该方法的特异性的计算公式(1)如下

特异性 ＝TN数 / (TN数＋FP数)×100% (1)

该方法的灵敏性的计算公式(2)如下

灵敏性 ＝TP数 / (TP数＋FN数)×100% (2)

2 结果与讨论

2.1 特异性和灵敏性实验

美洲锥虫和非洲锥虫的检测曲线如图1和图2所示。

2份钩端螺旋体、2份丝虫、2份健康人血液、2份健康人尿液均检出为阴性，曲线如图3所示。

由以上结果可知，TP ＝2 TN ＝8 FP ＝0 FN ＝0，特异性和灵敏性计算如下

特异性 ＝TN数 / (TN数＋FP数)×100% ＝100%

灵敏性 ＝TP数 / (TP数＋FN数)×100% ＝100%

可见，本检测方法特异性好，灵敏度高。

图1 美洲锥虫特异性实验检测曲线（Ct＝33.6）

Fig.1 Specific experimental detection curve of Trypanosoma cruzi (Ct＝33.6)

图2 非洲锥虫特异性实验检测曲线（Ct＝31.9）

Fig.2 Specific experimental detection curve of Trypanosoma brucei (Ct＝31.9)

图3 钩端螺旋体、丝虫、健康人血液、健康人尿液的检测曲线

Fig.3 Specific experimental detection curves of Leptospira, filariasis, blood and urine of healthy people

2.2 检测下限的确定

分别将美洲锥虫和非洲锥虫的阳性对照质粒进行10倍梯度稀释（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4），作为模板，用本方法进行检测，以确定其最低检测下限。 每个浓度重复检测3次， 结果见图4和图5。

图4 美洲锥虫检测下限实验检测曲线

Fig.4 Experimental detection curve of the lower detection limit of Trypanosoma cruzi

图5 非洲锥虫检测下限实验检测曲线

Fig.5 Experimental detection curve of the lower detection limit of Trypanosoma brucei

如图可知，美洲锥虫和非洲锥虫的阳性对照质粒的4个梯度稀释浓度均能全部检出，而在10^-4拷贝/mL的阳性对照结果中3条曲线已经不能聚集。因此，该方法检出下限为10^-4拷贝/mL。

2.3 重复性实验

取10^-2和10^-3稀释浓度的锥虫核酸样本，按照以上相同方法进行检测，每个样本检测10次，检测结果见图6和图7。由图6和图7可知，本检测方法对检测美洲锥虫和非洲锥虫的重复性好。

3 结论

目前，我国还不是锥虫病流行区，但随着国际间交流往来的密切，输入性锥虫病风险将会大大增加^[12]。中国不是美洲锥虫病的流行区域，尽管尚无美洲锥虫病病例的报道，但是亚洲人群对美洲锥虫普遍易感^[13]。我国已有3例输入性病例报道^[14]：2014 年，上海报道了1例^[15-16]；2017 年，福建和江苏分别报道了1例^[17-18]。由此可见，美洲锥虫病和非洲锥虫病的风险不容忽视。然而锥虫病目前依然尚无可靠疫苗^[19-20]，因此，早期检测、提早发现就显得尤为重要。本研究通过比较美洲锥虫和非洲锥虫的基因组的保守性与特异性，设计了针对性的两套锥虫特异性引物和探针用于核酸检测（美洲锥虫和非洲锥虫分别使用HEX和FAM荧光基团标记探针），从而建立了美洲锥虫和非洲锥虫的双重实时荧光 PCR 检测方法，通过一次上机实验就可以同时完成阴阳性检测和锥虫的分型。该方法的特异性较好，对其他样本，如钩端螺旋体、丝虫、健康人血液、健康人尿液等检测未出现假阳性。在多次重复美洲锥虫与非洲锥虫的检测实验中，均未发现假阴性，说明该检测方法稳定性高、可靠性强。同时，该方法灵敏度较高，最低检测限达10^-4拷贝/mL，即在较低浓度下也可以检测出阳性结果。利用本研究建立的双重实时荧光 PCR 检测方法可以同时对两种常见锥虫进行鉴别与分类，能够为美洲锥虫和非洲锥虫的准确检测提供新的技术和方法。该方法快速、灵敏、高效，结果准确，可用于对我国各大口岸输入性锥虫病的早期检测和分型。

参考文献

[1] Peerzada M, Gaur A, Azam A. Advances in Drug Discovery against Neglected Tropical Diseases: Human African and American Trypanosomiasis[J]. Curr Med Chem, 2021, 28(36): 7544-7582.

[2] Ersfeld K. Genomes and genome projects of protozoan parasites[J]. Curr Issues Mol Biol, 2003, 5(3): 61-74.

[3] Requena-Mendez A, Aldasoro E, de Lazzari E, et al. Prevalence of Chagas disease in Latin-American migrants living in Europe: a systematic review and meta -analysis [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2015, 9(2): e3540.

[4] Prata A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease[J]. Lancet Infect Dis, 2001, 1(2): 92-100.

[5] Stich A, Abel M, Krishna S. Human African trypanosomiasis[J]. BMJ, 2002, 325(7357): 203-206.

[6] WHO. Human African Trypanosomiasis. http://www.who.int/ trypanosomiasis african/en/.

[7] Geiger A, Simo G, Grebaut P, et al. Transcriptomics and proteomics in human African trypanosomiasis[EB]. current status and perspectives[M]. J Proteomics, 2011, 9(74): 1625-1643.

[8]刘琴,陈木新,李元元,等.非洲锥虫病的诊断和治疗[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(5): 435-442.

[9] Hotez P J, Dumonteil E, Woc-Colburn L, et al. Chagas disease: the new HIV/AIDS of the Americas[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2012, 6(5): e1498.

[10]陈小光,陈汉妹,黄小敏.用PCR方法检测锥虫感染[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2019, 42(6): 428-429+449.

[11]陈木新,陈家旭. 基因芯片技术在人体锥虫生物学特性研究方面的进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2016, 34(4): 377-381.

[12] Stevens J, Noyes H, Gibson W. The Evolution of Trypanosomes Infecting Humans and Primates[J]. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz, 1998, 93(5): 669-676.

[13]钱颖骏,李石柱,王强,等.中国输入性美洲锥虫病疫情的快速风险评估[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2013, 31(1): 57-59.

[14]王渊, 刘永杰, 付强, 等. 口岸输入性锥虫病概述及其防控[J]. 口岸卫生控制, 2019, 24(4): 60-62.

[15]孙懿, 黄韦华, 牛紫光, 等. 1例输入性非洲锥虫病的病原学鉴定[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2016, 34(4): 5.

[16]陈念, 金柯, 徐晶晶, 等. 输入性非洲锥虫病一例[J]. 中华传染病杂志, 2016, 34(5): 3.

[17]周菊静, 苏国平, 胡建忠, 等. 江苏省江阴市一起输入性非洲锥虫病的流行病学调查[J]. 医学动物防制, 2019(2): 2.

[18]林耀莹, 张山鹰, 谢汉国, 等. 一例输入性非洲锥虫病的实验室诊断[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(4): 4.

[19] Rodriguez-Morales O, Monteon-Padilla V, Carrillo-Sanchez SC, et al. Experimental vaccines against Chagas disease: a journey through history[J]. J Immunol Res, 2015, 2015: 1-8.

[20] Greca F L , Magez S. Vaccination against trypanosomiasis[J]. Human Vaccines, 2011, 7(11): 1225-1233.

基金项目：海关总署科技计划项目（2017IK004），西安海关科研项目（西关K-201904）

第一作者：王渊（1988—），男，汉族，陕西西安人，博士，高级兽医师，主要从事卫生检疫研究，E-mail: wangyuan0330@163.com

1. 陕西国际旅行卫生保健中心（西安海关口岸门诊部） 西安 710000

2. 西安海关 西安 710000

1. Shaanxi International Travel Healthcare Center (Xi'an Customs Port Clinic), Xi'an 710000

2. Xi'an Customs, Xi'an 710000