张 阳1 徐聪灵2 孙 涛3

关键词 寨卡病毒； RPA-LFD；快速检测；卫生检疫

Establishment and Evaluation of Detection Method for

Zika Virus Based on RPA-LFD

SONG Yue-Qian1 HAN Hui1*

Abstract The aim of this study was to establish a simple, sensitive and specific RPA-LFD detection system for Zika virus, which could be better used in port health quarantine and frontline detection. By screening primer design and optimizing reaction conditions, the RPA-LFD detection technique for Zika virus was established, and its sensitivity and specificity were evaluated. In addition, 41 clinical samples were tested to evaluate the feasibility and effectiveness of the detection system. Compared with fluorescence quantitative PCR (qPCR) and PCR, the results of RPA-LFD showed good sensitivity in the detection of Zika virus and no cross-reaction with common pathogens, and the results could be judged by the human eye. The results showed that it was very suitable for port health quarantine and frontline detection, with broad prospect for application .

Keywords ZIKV; RPA-LFD; quick test; health quarantine

寨卡病毒病是由寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）引起的，属于黄病毒科，主要通过伊蚊叮咬进行传播^[1]，是近年来重要的新发传染病之一。该传染病最近几年在拉丁美洲和加勒比海国家广泛流行，对人体具有较大的危害，能引起神经系统疾病，如格林巴利综合征，若孕妇感染则引起胎儿小头症等。随着全球贸易一体化，交通和旅游业飞速发展，我国也面临着寨卡病毒的输入性风险。

目前，针对ZIKV的检测方法主要有2种：①病原学检测，可以通过病毒核酸（PCR技术）、病毒抗原（免疫组化法）以及病毒分离培养进行检测；②血清学诊断，可以采用酶联免疫吸附法、免疫荧光法及中和试验等，检测寨卡病毒的IgM个和中和抗体，发病后7 d左右可以被检出。

PCR核酸检测技术对实验室资质、环境、仪器设备及实验人员都有较高要求，而可应用于基层及现场检测的快速且简便的核酸扩增技术相对缺乏。重组酶聚合酶扩增技术（RPA）相较于其他恒温核酸扩增技术，优势更加明显^[2-3]。该技术对样本及实验室要求较低，在25～45℃环境下反应3～10 min，即可将少量核酸分子扩增至可检出水平，结合侧流层析试纸条（LFD）形成RPA-LFD快速诊断方法，该方法的可视化诊断通过肉眼直接判定结果^[4-6]。RPA-LFD更加适合口岸现场、社区、门诊、基层等资源受限领域的应用^[7-9]，具有广阔的应用前景。

本研究是以RPA技术为基础，结合胶体金试纸条LFD，建立RPA-LFD检测体系，在临床上能够快速、准确地检测寨卡病毒，为现场快速筛查提供了一种新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

登革热病毒核酸、ZIKV核酸、黄热病毒核酸、基孔肯雅热病毒核酸和日本脑炎病毒核酸，均来自大连国际旅行卫生保健中心的媒介生物实验室、重庆国际旅行卫生保健中心的媒介生物实验室和江苏国际旅行卫生保健中心的媒介生物实验室。引物、探针及基因测序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；QIAamp Viral RNA Mini Kit购于QIAGEN公司；TwistAmp^TM exo RT kit和TwistAmp^TM nfo由英国TwistDx公司生产；PCR Master Mix试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；胶体金侧向流免疫层析试纸条购于杭州优思达生物技术有限公司；相关耗材（Tip头、EP管等）购于Thermal Scientific Fisher公司，均为无RNase、DNase和无热源的分子生物学耗材。

1.2 实验方法

1.2.1 ZIKV核酸检测及序列测定

参照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取ZIKV病毒总RNA。本课题检测方法参照了美国疾病预防控制中心的检测方法，以寨卡病毒E蛋白基因RNA为靶基因，上游扩增引物为ZIKV E-F（5'-CCGCTGCCCAACACAAG-3'），下游扩增引物为ZIKV E-R（5'-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3'），探针为ZIKV E-Probe（5'-FAMAGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAATAM-3'）。

1.2.2 ZIKV E基因质粒标准品的制备

以测序后的ZIKV E基因DNA为模板，50 μL反应体系，反应程序后将纯化过的核酸片段克隆到pMD18-T 载体上用于构建质粒，测定核酸含量按照公式计算：拷贝数（copies/μL）＝质粒浓度（ng/μL）10^-9×6.02×10²³/（660×质粒总长度），计算出ZIKV E基因质粒拷贝数为5.6×10⁶拷贝/μL。

1.2.3 引物的设计与筛选

根据 RPA 引物设计原则，在保守基因区域，设计3对候选引物及探针引物，从中选择最佳引物。上下游引物5'端分别用FAM和Biotin进行标记，扩增反应参照试剂盒说明书进行，反应条件采用37℃温育20 min，反应结束后测量荧光强度，选择强度最合适的一对引物。标记后引物用于RPA-LFD方法的建立。

1.2.4 RPA-LFD试纸条检测体系的建立

以拷贝数为10⁴拷贝/μL质粒标准品为模板进行反应条件的优化。通过对反应温度（25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃）以及反应时间 （5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min） 进行比对，选取最优化的反应温度和时间，将优化后的扩增产物均通过胶体金侧向流试纸条进行检测。

1.2.5 胶体金侧向流免疫层析试纸条反应装置使用方法

核酸扩增结束后，将0.2 mL PCR管放入胶体金侧向流免疫层析试纸条反应装置中观察结果，结果判定如下。①阳性：出现质控线和反应线两条红线，其中一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。②阴性：仅出现一条红色质控线，在检测区（T）内无条带出现。

1.2.6 灵敏度检测

以拷贝数为10⁴拷贝/μL的质粒标准品为模板，将构建的标准质粒作10倍倍比稀释至单拷贝/μL，分别进行RPA-LFD检测、实时荧光定量PCR（qPCR）和PCR检测，对比3种检测方法的敏感度。RPA扩增反应的温度、时间均按照优化后的条件进行，扩增产物通过胶体金侧向流免疫层析试纸条的检测，确定该方法灵敏度。每个试验至少重复3次，确定RPA-LFD方法的灵敏度。

1.2.7 特异性检测

以乙型脑炎病毒、基孔肯雅热病毒、黄热病毒和登革热病毒DNA为模板作为特异性反应对照组，模板浓度为10⁴拷贝/μL，按照优化后的条件进行RPA扩增反应，通过胶体金侧向流免疫层析试纸条检测扩增产物，观察试纸条T、C线颜色变化。对所建立的RPA-LFD检测方法进行特异性分析，每个试验至少重复3次，确定RPA-LFD方法的特异性。

1.2.8 样本检测

为了评估该RPA-LFD检测体系的实际应用效果，用RPA-LFD技术对25名健康志愿者和16个寨卡病毒核酸阳性样本进行检测，同时用传统的RT-PCR方法和qPCR法对上述样本进行检测，比较3种检测方法的灵敏度、特异性、阳性数等参数。

2 结果与分析

2.1 引物的筛选

根据荧光曲线产生的时间和荧光强度选择Zika-RPA-1引物，该引物在5 min左右即可产生荧光曲线，比其他引物更早，因此选择其作为建立RPA-LFD方法的引物。在此基础上依据探针设计原则设计RPA-LFD探针。结果显示3对引物均能够激发出荧光，如图1所示。

图1 引物的筛选

Fig.1 Primer screening

2.2 反应温度的优化

寨卡病毒RPA-LFD反应体系分别在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃条件下进行扩增结果显示（图2），25～42℃温度范围内均可有效扩增，37℃时侧向流免疫层析试纸条显色深度明显且均匀，因此本实验优选37℃作为后续试验 的反应温度。

图2 反应温度的优化

Fig.2 Optimization of reaction temperature

2.3 反应时间的优化

配置上述反应体系，37℃条件下进行反应，分别在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min终止反应，待全部反应结束后进行结果判读（图3）。综合实验时间和结果的可靠性，选取 最佳反应时间为20 min。

图3 反应时间的优化

Fig.3 Optimization of reaction time

2.4 灵敏度分析

通过将构建的标准质粒模板作10倍倍比稀释，分别选取10⁰～10⁴模板浓度进行RPA扩增，反应20 min，5 min内读取LFD的检测结果，结果显示该RPA-LFD检测方法可检出的最低量为10²拷贝/μL（图4），qPCR检测方法的最低限是10¹拷贝/μL（图5），普通PCR的检出限为10³拷贝/μL（图6），说明本试验所建立的RPA-LFD检测方法敏感性高于 普通 PCR ，低于荧光定量 PCR ，具有较高的敏感性。

图4 RPA-LFD灵敏度试验

Fig.4 RPA-LFD sensitivity test

图5 qPCR灵敏度试验

Fig.5 qPCR sensitivity test

图6 PCR的灵敏度试验

Fig.6 PCR sensitivity test

2.5 特异性分析

特异性实验结果：滴加至侧流试纸20 min内，只有寨卡病毒出现明显阳性条带，即出现质控线（C）和反应线（T）2条红线，其他病毒及阴性对照均只出现质控线（C），未出现反应线（T），如图7所示，证明引物和探针存在高度特异性。该实验表明本方法对寨卡病毒的检测具有良好的特异性。

图7 特异性试验

Fig.7 Specificity test

2.6 临床样本检测

应用ZIKV RPA-LFD、rt-PCR和qPCR检测方法分别对25名健康志愿者和16个寨卡病毒核酸阳性样本进行检测，结果显示：RPA-LFD检测出阳性15例、阴性26例，rt-PCR检测出阳性12例、阴性29例，qPCR检测出阳性16例、阴性25例。结果表明，本研究建立的ZIKV RPA-LFD检测方法灵敏度较高、特异性强，可用于现场检测。

3 结论

ZIKV为嗜神经病毒，可能会造成神经和自身免疫系统并发症（格林-巴利综合征^[10]），以及导致胎儿先天性小头畸形。控制该疾病最有效的措施是及时发现病例并进行隔离。目前，病毒核酸检测技术具有灵敏、快速、特异性高的优点，迄今已建立包括PCR、LAMP和qPCR^[11]等多种核酸检测分子生物学方法。PCR技术虽然具有良好的灵敏度和特异性，但对于实验室和人员均有较高要求，必须专业实验室才可以进行检测。在实际操作中，对现场或突发事件的病例筛查不能及时检测，很容易延误病情，造成严重后果，因此，探究并找到一种快捷、简单、灵敏、特异的ZIKV诊断技术非常必要。

本研究通过RPA-LFD技术对ZIKV进行检测，检测结果具有特异性，与常见病原无交叉反应；与qPCR技术和rt-PCR技术进行比较，在具有较好灵敏度的同时，能提高检测效率、缩短检测时间，仅十几分钟即可通过肉眼判断检测结果，不需要任何仪器设备，适合现场快速检测，弥补PCR技术无法进行现场筛查的缺陷。综上所述，RPA-LFD技术既具备PCR技术高灵敏度与高特异性优点，又摆脱了PCR技术对实验室、仪器和专业人员的依赖。RPA-LFD检测方法操作简单且无需专业资质的实验室人员，非常适合口岸卫生检疫、基层卫生部门的现场检测，具有极大的应用潜力。

参考文献

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基金项目：南京海关科研项目（2018KJ45）

第一作者：张阳（1980—），女，汉族，江苏南通人，本科，副主任技师，主要从事病原生物学研究，E-mail: 455892018@qq.com

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