刘甜甜1 王小羽1 江亚娟1 范莹莹1 焦伯延1*

关键词 境外输入；无症状感染者；新型冠状病毒；全基因组测序；新型冠状病毒肺炎

Whole Genome Sequencing of SARS-CoV-2 An

Imported Asymptomatic Case of COVID-19

LIU Tian-Tian1 WANG Xiao-Yu1 JIANG Ya-Juan1 FAN Ying-Ying1 JIAO Bo-Yan1*

Abstract The whole genome sequence of SARS-CoV-2 and its evolutionary characteristics of one imported asymptomatic case of COVID-19 was analyzed. The next generation sequencing technology was used to sequence of the whole genome of SARSCoV-2 of one sputum specimen collected from the case. Bioinformatics software was used in homology analysis, evolutionary tree construction and variation sites analysis. A 29724 bp length sequence of SARS-CoV-2 was obtained, which is of the closest origin to the sequence coded SARS-CoV-2/human/BGD/BCSIR_NILMRC_003/2020 from the importing country in the same month, with the nucleotide homology 99.99%. The sequence was distributed in the B.1.1.25 branch on the evolutionary tree. Compared to wuhan-hu-1, the sequence had 10 nucleotide mutation. 2 nucleotide mutations were located in untranslated regions (UTR), including C29686T mutation in 3'UTR. 8 nucleotide mutations were located in translated regions, resulting in 5 protein mutated including P323L mutation in RdRp and D614G mutation in S protein. Whole genome sequencing was an effective technology for SARS-CoV-2 detection and traceability, which could be used for traceability of overseas imported. The incubation period of a few SARS-CoV-2 infection could be up to 14 days. It was necessary to detect SARS-CoV-2 positive patients as soon as possible.

Keywords overseas imported; asymptomatic patients; severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; whole genome sequencing; coronavirus disease 2019

新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是单正链RNA病毒，属于冠状病毒β属，基因组全长约30 kb。基因组含有5'非编码区（5'untranslated regions，5'UTR）、3'UTR和12个开放读码框（open code reading frame，ORF）。开放读码框包括可编码刺突蛋白（spike protein，S）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）、包膜蛋白（envelope protein，E）和膜蛋白（membrane protein，M）4种结构蛋白开放读码器，以及8种非结构蛋白（nonstructural protein，NSP）开放读码器^[1-3]。

新型冠状病毒肺炎( coronavirus disease 2019，COVID-19)是由SARS-CoV-2感染引起的一种新发急性传染病，潜伏期一般1～14 d^[4]。目前，COVID-19是全球最重大的公共卫生事件之一。截至2022年1月，全球累计确诊超过3.2亿人，死亡超过500万人。全球疫情可能长时间暴发流行，我国面临的境外输入风险或将长期存在^[5-6]。

本研究对一例入境15 d无任何临床症状人员开展SARS-CoV-2核酸检测、抗体检测和2代高通量全基因组测序，对基因序列进行进化变异分析和同源性分析，明确为境外输入SARS-CoV-2无症状感染者，为新冠疫情防控提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

GeneRotex 96全自动核酸提取仪和病毒RNA提取试剂盒均购自西安天隆科技有限公司；新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）购自上海伯杰医疗科技有限公司；LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪购自Roche公司；MiSeq测序仪及测序试剂Miseq^® v2 Reagent Kit和Nextera^® XT Library Prep Kit均购自illumina公司；新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒和ncov拼接软件均购自北京微未来科技有限公司；新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）购自英诺特（唐山）生物科技有限公司。

1.2 流行病学调查

某男性病例于2020年5月7日从孟加拉国回国，5月20日核酸检测阴性，5月21日集中隔离满2周，5月22日返至济宁，经某县疾病预防控制中心检测痰标本核酸SARS-CoV-2 N基因和ORF1ab基因均为阳性，经济宁市疾病预防控制中心复核，明确为境外输入SARS-CoV-2 感染者。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测和抗体检测

5月22日和5月23日分别采集痰标本和血清标本，取 200 μL痰样本进行核酸提取和实时荧光定量PCR检测，具体操作步骤详见商品化试剂盒说明书。取10 μL血清样本进行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测，具体操作详见试剂盒说明书。

1.3.2 SARS-CoV-2全基因组测序

取5月22日痰标本提取的核酸20 μL进行逆转录和SARS-CoV-2全基因组捕获，具体操作详见北京微未来科技有限公司说明书。按照illumina公司测序流程说明书进行测序。利用ncov拼接软件进行SARS-CoV-2序列拼接。

1.3.3 序列分析

核苷酸、氨基酸同源性分析和进化树构建方法详见我们之前的研究^[7]。利用Pangolin分型法对SARS-CoV-2序列进行分型；利用RNAfold软件构建5'UTR和3'UTR二级结构；利用SOPMA 软件构建蛋白二级结构；利用NetPhos 3.1、iUbiq-Lys、GPS-SUMO和GPS-PAIL软件分别分析蛋白磷酸化、泛素化、SUMO化和乙酰化位点。

2 结果

2.1 流行病学调查及实验室检测

入境第15天，SARS-CoV-2核酸检测N基因和ORF1ab基因均阳性，SARS-CoV-2抗体检测IgM和IgG均阴性；入境第16天，核酸检测N基因和ORF1ab基因均阳性，抗体检测IgM阳性，IgG阴性。具体检测结果详见表1。济宁市级专家组结合流行病学调查结果、实验室检测结果和临床特征诊断该病例为境外输入SARS-CoV-2无症状感染者。

2.2 全基因测序

2020年5月22日痰标本核酸进行高通量全基因组测序，获得1条29724 bp的SARS-CoV-2全基因组序列，命名为JW-001，序列含有88723个腺嘌呤（adenine，A）、9548个胸腺嘧啶（thymine，T）、5842个鸟嘌呤（guanine，G）、5461个胞嘧啶（cytosine，C）。

表1 核酸检测和抗体检测结果

Table 1 Detection results of SARS-CoV-2 nucleic acid and antibody

2.3 进化分析

分析JW-001序列，并与邻近地区和孟加拉国早期SARS-CoV-2全基因组序列进行比较，利用MEGA 7.0.14软件构建SARS-CoV-2全基因组序列进化树。在进化树上，JW-001与孟加拉国序列SARS-CoV-2/human/BGD/BCSIR_NILMRC_003/2020（GenBank：MT578016.1，以下简称BGD-003）、BGD-002（GenBank：MT578017.1）同属B主分支B.1.1.25分支。如图1所示。

2.4 基因同源分析

利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基本局部比对搜索工具进行JW-001同源序列比对分析，发现JW-001与来自孟加拉国2020年5月份序列BGD-003同源性最高。

以wuhan-hu-1（GenBank：MN908947.3）、BGD-003和BGD-002全基因组序列作为参考，JW-001与wuhan-hu-1、BGD-003和BGD-002序列进行同源性分析，核苷酸同源性分别为99.97%、99.99%和99.98%。其中与wuhan-hu-1编码区相比，N基因同源性最低，核苷酸和氨基酸同源性分别为99.76%和99.52%。各基因同源性分析结果见表2。

2.5 非编码区变异分析

与wuhan-hu-1相比，JW-001在5'UTR发生了C241T变异，241位核苷酸位于5'UTR茎环结构SL5B的环结构^[8]。利用RNAfold软件分析5'UTR二级结构，JW-001和wuhan-hu-1的5'UTR二级结构高度一致，二级结构最小自由能均为-82.10 kcal/ mol，如图2-A和2- B所示。

A: wuhan-hu-1 5'UTR二级结构; B: JW-001 5'UTR二级结构; C: wuhan-hu-1 3'UTR二级结构; D: JW-001 3'UTR二级结构

图2 5'UTR和3'UTR二级结构

Fig.2 The secondary structure of 5'UTR and 3'UTR

3'UTR发生了C29686T变异。此外，与JW-001同一进化簇的BGD-002（图1）也发生了C29686T变异。经BLAST分析，截至2021年12月2日，在NCBI数据库共有3487条序列发生C29686T变异，占比为0.14%，说明C29686T变异普遍存在。29686位核苷酸位于3'UTR的高变区（hypervariable region，HVR）^[8]，利用RNAfold软件分析3'UTR二级结构，HVR的29683-29689位核苷酸与29815-29821位核苷酸互补形成茎结构，茎结构7对核苷酸中，wuhan-hu-1有6对互补，而发生C29686T变异的JW-001的7对核苷酸均互补，说明JW-001的3'UTR HVR结构更稳定；wuhan-hu-1的3'UTR最小自由能为-74.80 kcal/mol，JW-001的3'UTR最小自由能为-78.90 kcal/mol，如图2-C和2-D所示。

2.6 编码区变异分析

与wuhan-hu-1相比，JW-001的NSP2、RdRp、helicase、S蛋白和N蛋白的氨基酸位点发生了变异，见表3。

表3 JW-001氨基酸变异分析

Table 3 Amino acid variations analysis of JW-001

NSP2发生I120F变异。异亮氨酸（Isoleucine，I）和苯丙氨酸（Phenylalanine，F）均是疏水性氨基酸，疏水性氨基酸常位于蛋白质的内部。利用SOPMA 软件分析NSP2二级结构，发现I120F变异未改变NSP2二级结构性质，说明I120F变异对NSP2结构影响可能较小，见图3。

RdRp发生P323L变异。323位氨基酸位于RdRp的连接结构域（Interface）^[9]，P323L是SARS-CoV-2最重要的变异之一，P323L变异能够改变RdRp的结构，影响SARS-CoV-2的复制^[10-11]。目前，P323L突变株是最重要的流行株， B.1.1.7变异株（又称阿尔法变异株）、B.1.617.2变异株（又称德尔塔变异株）和B.1.1.529变异株（又称奥密克戎变异株）均发生P323L突变。

Helicase发生T61L变异。苏氨酸（threonine，T）是蛋白最重要的磷酸化位点，T磷酸化后能够影响蛋白功能^[12]。经NetPhos 3.1分析，T61不能被磷酸化，因此，T61L变异不改变Helicase的磷酸化水平。

S蛋白发生D614G变异。D614G是SARS-CoV-2最主要的变异形式之一，D614G变异能够改变S蛋白的结构和性质，使SARS-CoV-2感染能力变强，促进SARS-CoV-2的快速传播^[13]。D614G突变是新冠病毒最重要的突变之一，其中阿尔法变异株、德尔塔变异株和奥密克戎变异株均发生D614G突变。

N蛋白发生R203K和G204R变异。赖氨酸（Lysine，K）带正电荷，N蛋白R203K和G204R变异，K的正电荷量与邻近磷酸化基团静电作用，可以稳定N蛋白结构^[14]。此外，K是蛋白质翻译后最重要的修饰位点，经iUbiq-Lys、GPS-SUMO和GPS-PAIL分析，变异后的K不能被泛素化、SUMO化和乙酰化。说明R203K变异对N蛋白翻译后修饰水平影响可能较小。阿尔法变异株和奥密克戎变异株均发生R203K和G204R变异。

h:α-螺旋; c: 无规卷曲; e: 延伸链

图3 NSP2二级结构

Fig.3 The secondary structure of NSP2

3 讨论

COVID-19主要通过呼吸道传染，传染性强，人群普遍易感。虽然COVID-19在我国得到有效控制，但是国外疫情形势依然严峻，我国面临境外输入风险依然存在，因此做好COVID-19境外输入防控是一项长期任务，特别是针对潜伏期较长的无症状感染者，因其隐秘性强，较易引起疏忽，应引起高度重视。

实时荧光定量PCR检测、抗体检测和全基因组测序是实验室诊断SARS-CoV-2感染的核心技术^[4,15]，特别是全基因组测序能够获得病毒全基因序列信息，是SARS-CoV-2分型、进化变异分析、病毒溯源的关键，目前，全基因组测序广泛应用于SARS-CoV-2的检测和溯源^[6,16]。

本研究病例经孟加拉国入境，入境第15天SARS-CoV-2核酸检测N基因和ORF1ab基因均阳性，入境第16天，SARS-CoV-2抗体检测IgM阳性。为追溯病毒来源，本研究进行了SARS-CoV-2全基因组测序，获得1条29724 bp序列。经BLAST分析，与孟加拉国同月份序列BGD-003同源性最高，排除国内感染可能，明确为境外输入SARS-CoV-2无症状感染者。

JW-001属于B.1.1.25分支，与BGD-003相比仅存在2个核苷酸差异，同源性为99.99%；与wuhan-hu-1相比，JW-001存在10个核苷酸变异，变异覆盖非编码区和编码区。其中，5'UTR、ORF1ab基因、S基因、N基因和3'UTR发生了核苷酸变异，而NSP2、RdRp、helicase、S蛋白和N蛋白发生了氨基酸变异。

5'UTR和3'UTR是SARS-CoV-2的非编码区，可以形成复杂的二级结构参与SARS-CoV-2复制、翻译和组装等过程。5'UTR可以结合N蛋白参与病毒组装，结合翻译起始因子和核糖体参与ORF1ab基因的翻译，并可结合3'UTR参与病毒复制^[17-18]。3'UTR为RdRp提供结合位点，起始SARS-CoV-2复制^[18]。本研究JW-001的5'UTR和3'UTR均发生1个核苷酸位点变异。其中，5'UTR发生的C241T变异位于茎环SL5B的环结构，变异未能引起茎环SL5B结构的改变。但3'UTR发生的C29686T变异，致使HVR茎结构29686位的核苷酸T能够与29818位的核苷酸A互补，HVR的茎结构更加稳固。此外，大量SARS-CoV-2序列发生C29686T变异，说明C29686T变异可能在SARS-CoV-2进化变异和病毒复制过程中发挥一定作用，但仍需进一步研究确定。

S蛋白和N蛋白是SARS-CoV-2的结构蛋白，S蛋白形成SARS-CoV-2的刺突，能够结合宿主受体从而使病毒进入宿主细胞。N蛋白是SARS-CoV-2的核衣壳蛋白，参与病毒组装。RdRp是SARS-CoV-2的RNA依赖的RNA聚合酶，是SARS-CoV-2基因组的复制酶^[1-3]。Helicase是SARS-CoV-2的解旋酶，可与RdRp结合参与病毒复制，并可参与病毒mRNA加帽^[19]。NSP2是SARS-CoV-2的非结构蛋白。NSP2能够改变宿主微环境和信号传导^[20]。JW-001这些蛋白发生了变异,可能影响病毒蛋白的部分功能，特别是S蛋白D614G变异和RdRp的P323L变异能够改变SARS-CoV-2复制能力和感染能力。

4 结论

综上，本研究对一例入境15 d病例进行SARS-CoV-2核酸检测和抗体检测，确定为SARS-CoV-2症状感染者，通过SARS-CoV-2全基因组测序明确为境外输入，说明其潜伏期可能超过14 d。本研究为我国科学防控COVID-19境外输入提供依据，特别是为防控长潜伏期SARS-CoV-2无症状感染者提供参考数据。

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基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（202112060725），济宁市重点计划研发项目[医学研究和临床医学类(2021018)]

第一作者：刘甜甜（1986—），女，汉族，山东济宁人，本科，主管技师，主要从事疾病预防控制，E-mail: liutian_98@163.com 

通讯作者：焦伯延（1983—），男，汉族，山东济宁人，博士，副主任技师，主要从事微生物检验，E-mail: j198319831983@126.com

1.济宁市疾病预防控制中心 济宁 272000

1.Jining Center for Disease Control and Prevention, Jining 272000