林萍萍1 史云鹏1 安鹏天1

关键词 喹诺酮类药物；动物源性食品；残留；检测方法

Research Progress on Detection Methods of Quinolones Residues in Animal-derived Food

LIN Ping-Ping1 SHI Yun-Peng1 AN Peng-Tian1

Abstract In this paper, the research progress of detection methods of Quinolones was reviewed, including microbiological method, which features simple operation, low price and simple instrument and thus is suitable for rapid screening and detection, ELISA, which features high specificity, simple operation and high sensitivity and thus is suitable for a large amount of samples and rapid detection on the spot, and chromatography, which features high efficiency, high sensitivity and high accuracy and thus can be used to confirm samples. For the analysis of QNs residues in foods of animal origin, the appropriate detection method can be chosen according to the different detection requirements. After screening and testing, the suspected positive samples are confirmed by the national standard or standard test method, which is currently the most commonly used testing program. In the future, the development trend of QNs residue analysis is to develop rapid and reliable detection kits, and to realize high-throughput, rapid and accurate quantitative detection of multi-drug residues.

Keywords quinolones; animal-derived food; residues; detection methods

随着人们生活质量不断提高，动物源性食品安全问题越来越受重视，其中兽药残留超标是关注的热点^[1]。动物源性食品兽药残留超标是指动物可食用组织或加工产品中残留的原型药物、代谢产物等残留标识物超过最大残留限量。兽药残留超标的动物源性食品威胁人体健康，因此兽药残留一直是动物源性食品的监测项目，其中喹诺酮类药物为重点监测项目。喹诺酮类药物是人工合成的十分重要的广谱性抗菌药物，广泛用于畜牧及水产养殖业。但喹诺酮类药物的不合理使用会导致动物源性食品中此类药物残留超标，给食品安全与公共卫生安全带来隐患，因此有必要加强对动物源性食品中喹诺酮类药物残留的监测。喹诺酮类药物（quinolones，QNs）对革兰氏阴性菌和阳性菌均有杀菌作用，具有抗菌谱广、抗菌活性强、给药方便、价格低廉等特点，广泛应用于畜牧养殖业中。由于畜牧养殖业中不合理甚至滥用喹诺酮类药物，导致其在动物源性食品中残留超标，并通过食物进入人体，对人类的中枢神经系统以及胃肠道等器官造成损伤，严重威胁人类健康。为保障食品安全，中国、美国、日本及欧盟等国家及地区高度重视并制定了多种QNs的最高残留限量（maximum residue limits，MRLs），美国 FDA于2005 年禁止恩诺沙星用于禽类的细菌感染治疗；日本规定氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星在进口生鳗鱼及其制品中的MRLs为50 μg/kg^[2]；欧盟（EC）规定，达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星（含环丙沙星）、麻保沙星、沙拉沙星等在动物肌肉、肝脏和肾脏中的MRLs为100～1900 μg/kg；2015年9月1日我国农业部发布第2292号公告，规定在食品动物中停止使用洛美沙星、氧氟沙星、培氟沙星和诺氟沙星4种兽药。农业部在《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，鸡蛋中不得检出喹诺酮类药物。我国限量标准中规定，达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星（含环丙沙星）、噁喹酸、沙拉沙星等在动物肌肉组织中的MRLs为10～500 μg/kg（GB 31650-2019）。

目前，用于QNs残留检测方法有微生物法、酶联免疫分析法（ELlSA）、胶体金免疫层析法^[3-4]、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱质谱联用法、高效毛细管电泳^[5-6]等，其中，最常用的是高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法和ELlSA。本文对微生物法以及目前3种常用QNs残留检测方法进行综述，以期为我国动物源性食品中QNs残留监控提供参考。

1 微生物法

微生物法是利用QNs对微生物的抑制作用来确定样品中QNs残留。该方法具有操作简单、价格低、所用仪器简单等优势，适合大批量样品检测，但灵敏度较其他方法偏低，且不能进行定量，多应用于畜禽产品及水产品中兽药残留的快速筛查。范维等^[7]选用大肠杆菌为指示菌，制备96孔板，优化菌悬液初始浓度及检测体系，可以同时对15种QNs进行检测，在动物源性食品中该类药物检出限为40～200 μg/kg。该方法采用指示剂显色，因而比传统的以抑菌圈为判别标准更便于观察，且可在3～4 h内使指示剂变色，比传统方法省时省力，可用于动物源性食品中QNs残留的大规模初步筛查。

2 ELISA法

ELISA法是酶免疫分析中最常用的方法，在实际检测应用中，常采用间接竞争ELISA和直接竞争ELISA，因其具有特异性强、易操作、快速、灵敏度高等优点，适合现场操作和大批样品的筛选检测。关于检测QNs残留的ELISA方法的研究很多，且已从单一药物残留检测逐步发展到多药物残留检测。我国于2008年发布的标准《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测-酶联免疫吸附法》，可以检测12种QNs残留。该方法检测猪肉、鸡肉、鱼和虾样品的QNs残留最低检测限为3 μg/kg，蜂蜜样品为5 μg/kg，鸡蛋样品为2 μg/kg。樊晓博等^[8]建立了QNs残留直接竞争ELISA方法，该方法可以检测至少12种QNs残留，在生乳、鸡肉、鱼肉和虾肉4种样品中，12种QNs残留的最低检测限为0.15 μg/kg。魏东等^[9]和李新朋等^[10]建立的间接竞争 ELISA方法可同时检测动物性食品中的多种FQs残留。李建鲲等^[11-12]采用ELISA法测定肌肉和鸡蛋中的FQs残留，证实该方法检测结果稳定、可靠，适用于基层部门在监控环节对FQs残留进行监测。李燕君等^[13]建立同时快速检测牛奶中6种FQs残留的ELISA法，该方法的回收率、精密度、最低检测限等均符合兽药残留试验技术规范^[14]的要求，且具有较高的灵敏度、准确度，适合现场大批样品的快速检测。

3 HPLC法

HPLC法的原理是在高压状态下，利用液体作为流动相，通过高分离效能的色谱柱，使被检测的各组分分离，最后由荧光、紫外等检测器检测样品中QNs含量。该方法具有高灵敏度、快速、高效、检测范围广等优点，在食品检测和进出口检验检疫中得到广泛应用。

钱卓真等^[15]建立了水产品中6种QNs残留的HPLC荧光检测外标法定量测定方法，采用酸性乙腈溶液提取，经Bond Elut C₁₈净化，检出限和定量下限低，可以满足我国现行兽药残留检测分析的要求。宫秀杰等^[16]建立了检测牛奶中5种FQs残留的HPLC荧光检测法。该方法重复性好，操作简便快速，且方法回收率、检测限都能满足牛奶中残留检测要求。梁海斌^[17]建立了检测多种畜禽产品中5种FQs残留的QuEChERS-HPLC法，通过对前处理、流动相种类、配比等条件的优化，使其检出限、精密度和回收率均优于普通HPLC法（农业部1025号公告-14-2008^[18]），且准确度与HPLC-MS-MS法一致，而检出限比HPLC-MS-MS法（GB/T 21312-2007^[19]）和普通HPLC法（1025 号公告-14-2008^[18]）下降了50%。马春华等^[20]建立了测定鸡肉中3种FQs残留的QuEChERS-HPLC法，发现最低定量限为1 μg/kg，可缩短样品处理时间，提高检测效率，能够更好地满足国家规定的日常检测。

目前报道的高效液相色谱法多采用反相高效液相色谱法，也可采用离子对色谱法，可采用C₁₈、C₈、C₅等色谱柱，不同药物可根据药物特性选择不同的检测器，如紫外检测器（UVD）、二极管阵列检测器（DAD）或是荧光检测器（FLD）。FLD的灵敏度较UVD高，最低检测限可达到10 ng/mL左右，因此QNs残留检测较多选择带荧光检测器的反相HPLC法。目前，各国对QNs残留限量越来越低，HPLC虽然具有分离度好、准确度和灵敏度高、重复性好等优点，但是基于方法和仪器条件的限制，检测结果容易受到杂峰干扰，因此定性还不够准确且难以进一步降低检出限。

4 液相色谱-质谱联用法

随着质谱技术的发展和推广，质谱检测器与高效液相色谱或者超高效液相色谱结合使用被用于QNs残留检测中，应用较多的是液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。这种联用技术是以液相色谱为分离系统，以质谱为检测系统，结合了这两者的优点，较HPLC法不仅特异性更强、灵敏度更高、分析范围更广，而且可以对多组分残留进行检测。此类方法在QNs多残留检测中得到广泛应用^[19,21]，可同时对10余种QNs残留进行检测和确证。我国的国家标准建立了检测水产、蜂蜜、蜂王浆、畜禽肌肉组织等多种样品的LC-MS方法，可以同时检测10余种QNs，且检测限低于10 μg/kg。魏玉霞等^[22]建立了淡水鱼和淡水虾中同时测定11种QNs的UPLC-MS/MS法。该方法对样品采用酸化乙腈提取，经C₁₈基质分散固相萃取净化，基质匹配内标法定量，11种QNs残留的最低检出限为0.5～1.0 μg/kg，达到了限量标准要求，且前处理简单快速、灵敏度高、重现性好、回收率高，可以满足淡水鱼和淡水虾中QNs残留检测要求。魏丹等^[23]和虞冰等^[24]分别建立了测定水产品10种FQs残留的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）和15种FQs残留检测的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定方法，该方法比普通HPLC法具有操作简便快速、使用溶剂较少、灵敏度和准确度高、重复性好等特点，可以满足水产品中FQs残留分析的检测要求。马俊美等^[25]建立了牛奶中19种QNs的UPLC/Q-Orbitrap测定方法，样品采用酸化乙腈提取，经PRiME HLB固相萃取柱净化，在全扫描—数据依赖扫描模式下检测，该方法的检测效率、成本、灵敏度等方面优于GB/T 20366-2006和GB/T 21312-2007标准方法。王金秋等^[26]建立了猪肌肉中13种QNs残留的UPLC-MS/MS，样品采用Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液及磷酸盐缓冲液超声提取，经HLB柱固相萃取净化，采用电喷雾正离子模式检测，检测限均为1.0 μg/kg，操作简便快速、灵敏度高，适用于猪肌肉中QNs的定性与定量快速测定。张梦雪等^[27]建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中4种FQs残留，该方法简单、回收率及重现性好，可以满足检测需求。

液相色谱-质谱联用法凭借着灵敏度高、分离效率高、特异性强等优势，已成为QNs检测的主要技术手段，但样品前处理步骤烦琐，导致该方法在基层工作中难以普及。动物源性食品中QNs残留检测技术的重点难点主要是研究快速、简便、准确度高的前处理方法，而QuEChERS方法是一种发展迅速的前处理技术，具有分离效率高、经济环保、准确可靠等优点，是今后研究的方向。

5 结语

随着人们对动物源性食品中兽药残留越来越重视，对其检测方法的精确度要求也越来越高，人们不断探索研究新技术并将其应用于QNs残留的检测。其中微生物法检测限过高，且灵敏度低，特异性不强，适合于快速筛选；HPLC法和液相色谱-质谱联用法虽然具有准确度高、灵敏、重现性好等优点，但前处理步骤烦琐、所用仪器昂贵等，可用于QNs残留的定性定量分析；ELISA法特异性较强，操作简单，灵敏性高，适合大批量样品及现场监控的快速检测。目前，对于动物源性食品中QNs残留检测, 可以根据不同检测需求选择合适的检测方法，在对大批量样品快速筛查后，针对疑似阳性样品采取准确定性定量的检测方案是目前最常用且事半功倍的检测方案。未来QNs残留检测的发展趋势主要是：研究开发适合于大规模的简单、快速和更为灵敏可靠的多种QNs残留的检测试剂盒；研究灵敏度高且高效的联用技术和多药物残留确证技术。

参考文献

[1]张远,刘璞. 动物性食品中兽药残留问题及对策[J]. 中国动物检疫, 2005, 22(6): 17-19. 

[2]李小丽,蔡纯,陈胤瑜,等. 国内外动物源性食品兽药残留法规标准研究[J]. 中国乳品工业, 2011, 39(8): 37-39. 

[3]宗婧婧,张小军,严忠雍,等. 胶体金免疫层析法检测水产品中15种喹诺酮类药物[J]. 理化检验(化学分册), 2018, 54(5): 591-595.

[4]刘烜,郑文杰,贺艳,等. 胶体金免疫层析法快速检测组织样品中喹诺酮类药物残留[J]. 食品研究与开发, 2009, 30(5): 131-134.

[5]周梅仙,周业飞,刘文琪,等. 高效毛细管电泳法分离检测鸡蛋中3种喹诺酮类抗菌药[J]. 西北农业学报, 2013, 22(3): 38-43.

[6]吴凌荔,秦卫东. 喹诺酮类抗生素的高效毛细管电泳法分离检测[J]. 北京师范大学学报（自然科学版）, 2006, 42(1): 66-69.

[7]范维,高晓月,陈超,等. 动物源性食品中喹诺酮类药物残留的检测[J]. 肉类研究, 2017, 31(4): 36-42. 

[8]樊晓博,谢兰心. 酶标抗原直接竞争ELISA检测食品中氟喹诺酮类药物多残留[J]. 食品科学, 2015, 36(24): 265-269. 

[9]魏东,李颖,郭昌明,等. 氟喹诺酮类药物间接竞争ELISA检测方法的建立[J]. 吉林农业大学学报, 2009, 31(1): 97-101.

[10]李新朋,姜金庆, 钱爱东, 等. 氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立[J]. 中国农业科学, 2014(23): 4696-4705.

[11]李建鲲,俞成山,刘冬梅,等. 酶联免疫法测定肌肉中氟喹诺酮类药物效果探讨[J]. 食品安全质量检测学报, 2018, 9(13): 3263-3266.

[12]李建鲲, 徐泽权, 刘晓蓉, 等. 酶联免疫吸附法测定鸡蛋中氟喹诺酮类药物效果探讨[J]. 新疆畜牧业, 2018, 33(6): 22-24.

[13]李燕君,谭梅,岳秀英,等. 牛奶中氟喹诺酮类药物残留同步快速检测的酶联免疫吸附法研究[J]. 中国兽药杂志, 2020, 54(1): 46-52. 

[14]中华人民共和国农业部. 关于发布《兽药残留试验技术规范(试行)》的通知[EB/OL]. (2003-01-22)[2019-05-15]. http://www. moa.gov.cn / govpublic/SYJ/201006/t20100606 _ 1535497. htm

[15]钱卓真, 苏秀华, 魏博娟, 等.高效液相色谱法同时测定水产品中6种喹诺酮药物的残留[J]. 食品科学, 2010, 31(6): 185-189.

[16]宫秀杰,萨仁高娃,阿力腾才斯克,等.牛奶中氟喹诺酮类药物残留的HPLC检测方法研究[J]. 草食家畜, 2020(4): 57-62. 

[17]梁海斌. QuEChERS-高效液相色谱法检测不同畜禽产品中5种氟喹诺酮类的药物残留[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(1): 182-186.

[18] 农业部1025号公告-14-2008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 高效液相色谱法[S]. Ministry of Agriculture No. 1025-14-2008 Detection of fluoroquinolones residue in animal food by high performance liquid chromatography[S].

[19]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法: GB/T 21312-2007[S]. 北京:中国标准出版社, 2007.

[20]马春华,陈文文,邢越. QuEChERS结合高效液相色谱法快速检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留[J]. 食品工程, 2020(3): 58-61.

[21]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.动物源产品中喹诺酮类残留量的测定液相色谱-串联质谱: GB/T 20366-2006[S]. 北京:中国标准出版社, 2006.

[22]魏玉霞, 王芳, 左郡, 等. QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定淡水鱼和淡水虾中的11种喹诺酮类兽药残留量[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(7): 2906-2912.

[23]魏丹,国明,张菊.加速溶剂萃取-磁固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中10种氟喹诺酮类药物残留[J]. 色谱, 2020, 38(12): 1413-1422.

[24]虞冰,刘莉,吾建祥,等. UPLC-MS/MS法测定水产品中15种氟喹诺酮类兽药残留[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(7): 1405-1407. 

[25]马俊美,范素芳,孙磊,等.超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定牛奶中19种喹诺酮类抗生素[J].中国食品学报, 2021, 21(1): 309-317. 

[26]王金秋,马建民,夏曦,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肌肉中13种喹诺酮药物残留[J].质谱学报, 2014, 35(2): 185-192.

[27]张梦雪, 刘松雁, 王志恒, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氟喹诺酮类药物[J]. 今日畜牧兽医, 2019, 35(12): 3-4.

第一作者：林萍萍（1987—），女，汉族，河北沧州人，兽医师，硕士，主要从事进出境动物疫病检疫的研究，E-mail: weichen-lin@163.com

1. 黄骅港海关 沧州 061600

1. Huanghua Port Customs, Cangzhou 061600