杨燕强1 张鑫鑫1* 康 杰1 秦 军1 武 曦2

关键词 左氧氟沙星；离子液体；分子拥挤；分子印迹聚合物；固相萃取

Rapid Determination of Levofloxacin in Aqueous Media

by Molecular Imprinting-Solid Phase Extraction

YANG Yan-Qiang1 ZHANG Xin-Xin1* KANG Jie1 QIN Jun1 WU Xi2

Abstract Molecular crowding reagents and ionic liquids were used as reaction solvent to synthesize the molecular imprinting polymer. Based on this principle, with levofloxacin (LEV) as the template, polymethyl methacrylate (PMAA) as molecular crowding agent, 1-butyl 3-four fluoboric acid methyl imidazole salt ([BMIM] BF4)(ionic liquid) as reaction solvent, methylacrylic acid (MAA) as functional monomer, and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as the associating agent, dimethyl allyl levofloxacin molecularly imprinted polymer with good imprinting effect was prepared by using dimethyl sulphoxide/ionic liquid/polymethyl methacrylate at the ratio of 1.0:1.6:5.0 as the initiator and chloroform (150 mg/mL) as the pore forming agent. The prepared imprinted polymer was characterized and tested by absorption test. The results showed that levofloxacin imprinted polymer had good selective recognition performance for levofloxacin, and levofloxacin imprinted polymer could be used as adsorbent combined with solid phase extraction technology for the determination of levofloxacin content in aqueous media.

Keywords levofloxacin; ionic liquids; molecular crowding; molecularly imprinted polymers; solid-phase extraction

左氧氟沙星（LEV）作为氟喹诺酮类的合成抗菌药，可抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的DNA促旋酶，并且对非典型的病原体也有活性，如支原体、衣原体^[1]等。近年来，氟喹诺酮类抗菌药研发领域发展迅猛，新合成药物不仅抗菌作用强，吸收更好，组织浓度更高，同时具备低毒性、低价位和强组织通透性的优点，因此被广泛应用于人体或动物体的肠道感染、呼吸道感染等疾病治疗，但也会对人体造成一定的不良反应，如肌腱损伤、肌肉萎缩、心脏问题和假膜结肠炎等^[2]。同时，此类药物经人体和动物体代谢后直接排入环境中，将对土壤、水质等造成一定的危害，研究表明水环境中氟喹诺酮类污染尤为严重。对生态环境和人类健康均具有一定的潜在危害，因此对水性介质中左氧氟沙星（LEV）等药物含量检测非常必要^[3]。图1为 左 氧氟沙星 （LEV）的结构示意图。

图1 左氧氟沙星（LEV）结构示意图

Fig.1 Schematic diagram of levofloxacin (LEV) structure

药物残留检测的预处理方法种类繁多^[4]，其中分散固相萃取法是一种常被用于动物源食品中喹诺酮类药物残留检测的前处理方法，但采用的商业化固相萃取吸附剂种类多，存在对目标物选择性吸附效果差、针对特殊基质无法充分净化等弊端。为改善传统固相萃取吸附剂的缺陷，可通过将分子印迹技术应用于固相萃取技术，对前处理方法进行优化并应用于药物残留量的检测^[5-7]。

分子印迹技术是指制备空间结构和结合位点与模板分子完全匹配的分子印迹聚合物的技术^[8]。分子印迹聚合物（MIPs）首先通过聚合反应将待分离的目标分子与交联剂进行聚合并得到固体介质，然后使用物理手段除去介质中的目标分子，继而得到所需要的分子印迹聚合物。基于分子印迹聚合物（MIPs）可选择性识别模板分子的特性，可将分子印迹聚合物作为吸附剂对复杂样本中的目标物进行富集和纯化，以达到优化固相萃取技术，满足对不同复杂基质中目标物富集的需要。研究表明，离子液体作为一种新型绿色溶剂，其较好的溶解性可有效提高化合物合成过程中的反应速率和生成产率，因此，分子印迹聚合物可在室温离子液体中进行制备^[9]。另外，分子拥挤试剂对于形成生物稳定的三维结构过程发挥重要作用^[10]，可通过提高模板和功能单体之间的相互作用加快分子印迹聚合物（MIPs）的生成^[11]。因此，选择合适的离子液体和拥挤试剂是合成分子印迹聚合物（MIPs）的关键。

本研究选用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[BMIM]BF₄）为反应溶剂，聚甲基丙烯酸甲脂（PMAA）为拥挤试剂，左氧氟沙星（LEV）为模板，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）为关联剂，制备生成印记效果较好的左氧氟沙星（LEV）分子印迹聚合物，并结合固相萃取技术，用于选择性吸附水性介质中的左氧氟沙星，采用高效液相色谱法达到快速检测水性介质中左氧氟沙星含量的目的。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

试剂：左氧氟沙星（LEV）标准品（分析纯）由北京紫竹药业有限公司提供；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，98%），聚苯乙烯（PS，99%），α-甲基丙烯酸（MAA，99%），聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，99%），2,2-偶氮二异丁腈（AIBN，99%）由阿拉丁试剂有限公司提供；二甲基亚砜（DMSO，分析纯），无水乙酸钠（分析纯）由天津市大茂化学药剂厂提供；乙腈（分析纯）由天津奥普升化工有限公司提供；甲醇（分析纯）、乙酸（分析纯）、氯仿（分析纯）均由天津市凯通化学试剂有限公司提供；氨溶液（分析纯）由天津市北方天涯试剂厂提供；[BMIM]BF₄离子液体（分析纯）由上海成捷化学有限公司提供。缓冲盐：4.0 g醋酸铵、7.0 g高氯酸钠加水溶解稀释至1000 mL，用磷酸调节pH＝2.20。

标准溶液及标准系列配置：取适量左氧氟沙星（LEV）标准品，置于50 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，配置成标准储备液；根据实验要求精准吸取一定量的标准储备溶液，用流动相配置标准工作溶液。

仪器：L-2000高效液相色谱仪（配紫外可见光检测器），日本日立公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 印迹聚合物制备过程

(1)印迹。以1.0 mmol左氧氟沙星为模板，将20 mg功能单体α-甲基丙烯酸（MAA）、26.0 mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、20 mg 2, 2-偶氮二异丁腈（AIBN）3种试剂溶解在含有1.0 mL二甲基亚砜（DMSO）、1.6 mL 离子液体[BMIM]BF₄和5 mL氯仿（溶有0.75 g聚合物丙烯酸甲脂）的混合致孔剂中。

(2)聚合。将反应混合物通氮气10 min，密封到玻璃瓶中，置于60℃下的恒温水浴锅中反应24 h后，得到分子印迹聚合物。

(3)萃取。将生成物放入研钵中压碎过筛，收集直径范围32～75 μm的微粒，在索氏提取器中用乙酸-甲醇（1:9，v/v）的溶液对生成物中的聚合物进行抽提，除去其中的模板和聚甲基丙烯酸甲脂（PMMA），然后将所得的分子印迹聚合物用乙醇洗涤3次后放入烘箱中，在60℃环境下烘干。

同时制备不加模板分子LEV的左氧氟沙星无印迹聚合物（LEV-NIPs），制备过程与制备LEV-MIPs相同。

1.2.2 印迹聚合物吸附性能实验

通过静态平衡吸收实验和动力学平衡吸收实验，对比研究其选择性、特异性、结合能力。

(1)静态平衡吸收实验。在5.0 mL离心管中分别加入20 mg的左氧氟沙星分子印迹聚合物和左氧氟沙星无印迹聚合物，再与3.0 mL的左氧氟沙星标准溶液（0.01～0.5 mmol/L）进行混合，并在室温下放置24 h。将得到的悬浊液用离心机进行分离、过滤后，用高效液相色谱仪分别对吸附在分子印迹聚合物和无分子印迹聚合物上的左氧氟沙星分子进行含量测定。与聚合物结合的左氧氟沙星的吸收能力（Q）计算公式如下：

式中C₀为左氧氟沙星的初始浓度，C₁为左氧氟沙星的终了浓度，V为标准溶液的体积，m为聚合物的质量

(2)质量吸收动力学实验。除了恒定浓度（0.1 mmol/L）和不同间隔时间（1～100 min）外，质量吸收动力学方法与静态平衡吸收方法相同。

1.2.3 LEV-MIP吸附实验及目标物检测

实验选取长治市漳泽水库的水样，在水本中分别加入1.0 ng/g、4.0 ng/g、20 ng/g的LEV，用200 mg分子印迹聚合物分别吸附这些水性介质中的LEV，吸附得到含LEV的试液经高效液相色谱仪检测。

1.3 色谱仪器条件

HITACHI LaChrom C₁₈色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：缓冲盐-乙腈（95:15）；检测波长294 nm；柱温1.0 mL/min；进样量10 μL。

2 结果和讨论

2.1 LEV-MIPs合成原料的选择

由于致孔剂的性质将决定分子印迹聚合物最终的结构和形态，因此在分子印迹聚合物聚合过程中致孔剂的选择至关重要^[12]。为获得对左氧氟沙星具有特异性识别的分子印迹聚合物，一般选择溶解在氯仿中的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）或聚苯乙烯（PS）作为分子拥挤试剂^[13]。实验表明，聚苯乙烯在氯仿中的溶解度相对较小，因此选择聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为分子拥挤试剂。同时，分子拥挤试剂（PMMA或PS）是非极性或弱极性的大分子，不能溶解在极性致孔剂中，当加入极性溶剂DMSO时，可以较好地解决此问题。致孔剂在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）中的最佳配比为DMSO:[BMIM]BF₄:氯仿（v:v:v）= 1:1.6:5。

左氧氟沙星印迹聚合物（LEV-MIPs）模板选择时，发现氢键的强相互作用不仅能在LEV的氨基和MAA羧基之间形成，而且在LEV的羧基和MAA的羧基之间也能形成。通过氢键可实现LEV-MIPs对LEV的特异性吸附，因此选择LEV作为左氧氟沙星印迹聚合物（LEV-MIPs）模板。

2.2 LEV-MIPs吸附性能研究

随着LEV初始浓度的增加，LEV-MIPs和LEV-NIPs对LEV的吸附量也增加，并且LEV-MIPs对LEV的吸附量明显比LEV-NIPs高，见图2。

动力学平衡实验结果表明，LEV-MIPs可吸附大量的LEV，并且在40 min内LEV-MIPs上结合LEV的数量增加较快，60 min后达到平衡。但对于LEV-NIPs来说，仅20 min就达到了吸附平衡。这说明LEV找到LEV-MIPs的印迹位点并加以键合需要一定的时间，但键合数量较多，见图3。

以上实验可看出键合在LEV-MIPs上的LEV量比键合在LEV-NIPs上的多，这说明LEV-MIPs对LEV有很高的选择性。

图2 LEV-MIPs和LEV-NIPs对LEV的等温吸附曲线

Fig.2 Isothermal adsorption curves of LEV-MIPs and LEV-NIPs on LEV

图3 LEV-MIPs和LEV-NIPs对LEV的吸附动力学平衡曲线

Fig.3 LEV adsorption kinetic equilibrium curves of LEV-MIPs and LEV-NIPs

2.3 条件优化实验

2.3.1 使用量选择

分别取适量的LEV-NIPs 50 mg、100 mg、150 mg、200 mg用于吸附10 mL 0.1 μg/mL水样中的LEV，结果表明：当使用LEV-NIPs的量低于200 mg时，LEV吸附回收率均低于90.1%，相对标准偏差RSD 小于4.9%；当LEV-NIPs的用量为200 mg时，LEV吸附回收率为97.8%，相对标准偏差RSD小于4.6%，进一步增加LEV-NIPs的使用量，则回收率降低，因此选择LEV-NIPs使用量为200 mg。

2.3.2 pH的优化

左氧氟沙星（LEV）是两性化合物，LEV以阴离子、中性、阳离子3种形式存在于水相中（pKa₁＝5.9～6.1，pKa₂＝8.2～9.2），因此LEV在LEV-NIPs上的保留主要依赖于溶液的pH。用LEV-NIPs选择性吸附不同pH水样中的LEV，然后用含4% NH₃的甲醇溶液冲洗印迹在LEV-NIPs上的LEV，通过检测冲洗液中LEV的含量检测回收率。结果表明：当水样pH为6～8时，可得到满意的LEV回收率（99.5%，RSD≤4.1%），但在酸化（pH＝2.0）和碱化（pH＝12）的水样中得到LEV回收率较低（≤25.3%，RSD≤3.9%），这是源于LEV是通过静电作用吸附在LEV-NIPs上。当pH为6～7时，大多数的LEV是中性的，有利于静电作用；当pH很高时，由于LEV的去质子化，LEV在LEV-NIPs上的吸附量减小很多；当pH很低时，LEV-NIPs或LEV中羧基的电离被抑制。因此，LEV和LEV-NIPs之间的相互作用也随之减小。

以上结果说明LEV-NIPs通过静电作用与目标物结合，不仅不能特异性识别左氧氟沙星分子，而且易受体系pH的影响，因此传统固相萃取法中使用左氧氟沙星无印迹聚合物（LEV-NIPs）对目标复合物吸附萃取存在一定弊端。

2.3.3 LEV-MIPs萃取效率的选择性、稳定性、重现性

本研究制备构建的左氧氟沙星印迹聚合物（LEV-MIPs）因其独特的特异识别作用，克服LEV-NIPs对目标物吸附萃取的弊端，在优化的实验条件下对实际复杂样本中LEV的萃取均具有一定稳定性和适用性，通过在选取的水性介质样本中分别加入1.0、4.0、20 ng/g的LEV，按照方法“1.2.3”对每个添加浓度进行6个平行试验，结果见表3。由表3可知回收率均在90.1%～98.4%之间，相对标准偏差小于4.8%，并以方法最低添加浓度为定量限（LQD），水性介质中左氧氟沙星的LOQ为1.0 ng/g。

2.4 LEV-MIPs在样品检测中的应用

将LEV-MIPs和LEV-NIPs作为吸附剂分别对水质样本中含量为1.0 ng/g左氧氟沙星进行吸附，通过高效液相色谱仪检测分析。结果如图4～5 所示。

图4 经LEV-MIPs富集后1.0 ng/g LEV高效液相色谱图

Fig.4 1.0 ng/g LEV HPLC after LEV-MIPs enrichment

图5 经LEV-NIPs富集后1.0 ng/g LEV高效液相色谱图

Fig.5 1.0 ng/g LEV HPLC after LEV-NIPs enrichment

从图4～5可知，LEV-MIPs吸附LEV的量明显高于LEV-NIPs吸附LEV的量，说明作为吸附剂的LEV-MIPs比LEV-NIPs对LEV的吸附效果好，由此可知：LEV-MIPs对于复杂水质样本中的左氧氟沙星的吸附富集效果良好，可将其应用于水性介质中目标物的快速检测，满足一般水性介质中左氧氟沙星残留量检测的要求。

3 结语

本研究通过选择合适的离子液体作为反应溶液，与分子拥挤试剂制备一种左氧氟沙星分子印迹聚合物（LEV-MIPs）。通过条件优化、验证实验证明，LEV-MIPs具备对LEV有特异性吸附的特点，可将其作为吸附剂用于固相萃取技术中对LEV进行吸附富集，并通过高效液相色谱法对目标物检测。结果表明，LEV-MIPs作为固相萃取吸附剂，吸附能力强、回收率高、精密度高，可应用于一般水性介质中左氧氟沙星残留量的检测。

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基金项目：海关总署科研项目（2020HK217），国家自然科学基金（21905030）

第一作者：杨燕强（1967—），男，汉族，山西长治人，本科，高级工程师，主要从事食品、环境等质量安全分析检测，E-mail: 15803559996@163.com

通讯作者：张鑫鑫（1983—），女，汉族，山西高平人，硕士，高级工程师，主要从事食品、环境等质量安全分析检测，E-mail: 449315829@qq.com

1.太原海关技术中心 太原 030000

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1. Taiyuan Customs Technical Centre, Taiyuan 030000

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