林萍萍 史云鹏 安鹏天

我国是世界上野生动物种类最丰富的国家之一，然而随着人类文明和全球经济的不断发展，野生动物及其制品的非法贸易活动越来越猖獗，严重威胁野生动物的生存，保护野生动物资源和严厉打击野生动物及其制品非法贸易迫在眉睫。在保护执法过程中，对涉案的野生动物及其制品进行准确地物种鉴定和地域来源调查等是要解决的首要问题。由于涉案的检材类型多种多样，采用的鉴定方法也很多，传统的形态鉴定法、显微鉴定法等比较直接、简便，但对检材的质量要求较高，而在实际工作中，许多检材已缺失了整体的形态学特征，不易于辨认，如皮、毛、肉、骨头及其制品，因此，基于遗传物质的DNA物种鉴定技术应运而生，该技术能够对未知检材的种类、来源地等进行准确鉴定，为执法机关提供准确、高效的数据支撑。本文主要对我国濒危野生动物资源和目前常用的几种DNA物种鉴定技术进行综述，希望为濒危野生动物保护和科研工作提供一定参考。

1 我国濒危野生动物概况

1.1 我国濒危野生动物现状

我国幅员辽阔，地形及气候差异大，形成了多样的生态系统，为多种野生动物提供了天然的栖息环境。据不完全统计，我国陆生脊椎野生动物种类达2100多种（爬行类320多种、鸟类1180多种、哺乳类450多种、两栖类210多种），占世界陆生脊椎野生动物总数的10%左右^[1]。由于受到人类非法捕猎以及栖息地被破坏等因素影响，导致全世界有150多种鸟类、近110种哺乳动物已完全灭绝。我国是濒危野生动物分布大国，《濒危野生动植物种国际贸易公约》列出的600多种世界濒危物种中，我国的濒危动物有120多种，占比达到24%^[2]。目前在我国已经灭绝的动物有野马、新疆虎、豚鹿、白臀叶猴、麋鹿等，正处于灭绝边缘的有兽类54种，如东北虎、华南虎、雪豹、海南坡鹿等；鸟类23种，如朱鹅、白鹳等；爬行类50种，如扬子鳄、海龟等；两栖类15种，如大鱿、中国小鱿等。

1.2 野生动物致濒因素分析

1.2.1 自然灾害对野生动物的威胁

自然灾害是导致野生动物濒危和灭绝的重要原因。自然灾害可直接造成野生动物栖息地的破坏，使得某些数量较少的野生动物死亡，如1998年长江流域的洪灾，给平原和丘陵地区许多野生动物带来灭顶之灾；汶川大地震造成23%的大熊猫栖息地被破坏；2008年南方地区严重的冰雪灾害，同样给野生动物造成了严重的损害^[3]。此外，由自然灾害所造成的食物严重匮乏，可间接导致某些野生动物饥饿而死亡。

1.2.2 野生动物栖息地破坏与丧失

随着我国经济的不断发展，人类活动对自然资源的过度开发利用，如修建道路^[4]、毁林开荒^[5]、工程建设^[6]、围湖造田等，都会导致野生动物栖息地的破坏或急剧变化，包括退化、丧失和碎裂等，最终导致野生动物走向濒临灭绝的困境，近40年来变化速度明显加快。鱼类、水禽类、两栖类动物濒危的主要原因是围湖造田和占用滩涂。兽类、鸟类、爬行类以及昆虫濒危的主要原因是森林砍伐、开荒种地以及过度草原放牧。

1.2.3 环境污染对野生动物的影响

环境污染也会导致野生动物的濒危。在人类生产生活过程中大量使用农药、化肥，开采煤炭、石油等，产生大量的有害物质严重污染大气、土壤和水体，间接影响野生动物健康和繁衍，导致野生动物濒临灭绝。

1.2.4 人类经济活动对野生动物的影响

由于野生动物具有较高的经济价值和商业价值，在市场需求和经济利益的驱使下，野生动物非法贸易、走私活动猖獗是导致野生动物濒危的主要原因。全世界1/3的鸟类和哺乳类受到野生动物非法贸易的威胁^[7]，30%的野生鱼类被过度捕捞^[8]。据不完全统计，世界上每年因野生动物贸易、走私活动造成200多万只陆地动物、30万～100万头海洋哺乳动物遭到捕杀^[9]。野生动物贸易活动涉及世界各地，其中最大的野生动物及制品输出地是非洲，其次是亚洲、中美洲。非法贸易活动所涉及的野生动物种类非常多^[10]，2008—2018年我国海关公布的非法野生动物及其制品走私案件达390起，涉及多达109种野生动物，其中，兽类、鸟类、爬行类、两栖类和其他占比分别为35.78%、11.93%、31.19%、2.75%和18.35%。被走私较多的是象牙及其制品、动物皮毛及其制品、穿山甲及其制品等，其次是龟类及其制品、动物角类、蛇类及其制品、昆虫及其制品等，此外，还有虎骨、麝香、熊胆及熊掌、大量鳄鱼及其制品等^[11]。

2 野生动物及其制品鉴定技术

目前，国内外常用的野生动物及其制品鉴定技术主要有两类：一类是基于形态学、化学等的形态鉴定、显微鉴定、生化分析鉴定等非DNA鉴定技术；另一类是基于分子生物学水平的DNA物种鉴定技术。随着分子生物学鉴定技术的发展，DNA物种鉴定技术在濒危野生动物物种鉴定中得到了广泛应用，极大地弥补了传统形态鉴定的不足^[12]。

2.1 野生动物及其制品的非DNA物种鉴定技术

2.1.1 形态鉴定技术

形态鉴定技术是通过肉眼对检材的形态特征进行观察和测量并结合文献资料来鉴定物种，这是最传统也是最基础的鉴定方法，其在物种鉴定中有着非常重要的地位。对于具有完整特征或者形态特征没被破坏的野生动物及其制品可采用形态鉴定法，如动物的骨骼（虎骨、豹骨等）常被用作中药材，可根据其骨骼特点来对其进行物种鉴定^[13-14]。

2.1.2 显微鉴定法

显微镜鉴定实际上是形态鉴定的延伸，也是物种鉴定的基本技术之一。针对肉眼无法直接辨别的检材，需借助仪器从显微或亚显微结构和形态对检材进行区分来鉴定物种。张余等^[15]通过显微镜放大观察可以区分犀牛角与牛角、驴蹄等仿制品。随着显微技术的发展，荧光显微镜、相差显微镜、偏光显微镜等被应用于物种鉴定，其在毛发、骨骼、蹄甲、动物类药材等检材的鉴定中一直被沿用。

2.1.3 生化分析鉴定

以动物体内的生化性状如血型、血清蛋白、同工酶进行红细胞血型分析、血清蛋白质分析、酶型分析等，来对野生动物及其制品进行物种鉴定，但是一般蛋白质、同工酶具有生物活性，在高温、紫外线照射、强酸强碱作用以及细菌等因素的破坏下易于变性降解。因此，该方法受检材采集的时间、空间限制，从而在一定程度上限制了其发展和应用。

2.1.4 红外光谱技术

红外光谱技术由于具有操作简单快捷、用样少等特点，在野生动物毛发的识别与鉴定领域发挥着越来越重要的作用，郭海涛等^[16]利用红外光谱技术对云豹、藏狐等野生动物毛发进行分析鉴定。

2.2 野生动物及其制品的DNA物种鉴定技术

在执法鉴定和野外生态调查等案件中涉及的检材通常是毛发、骨骼、肌肉组织、角制品等微量样品或丧失了其整体的形态学特征，不能利用形态学等传统鉴定技术进行物种鉴别。近年来，随着生物学技术的发展，DNA物种鉴定技术具有不受环境或其他因素影响且特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，已广泛应用于动物物种鉴定，成为当前野生动物及其制品鉴定的重要技术。根据鉴定目的不同，可选择有效的核DNA或线粒体DNA（mtDNA）上的目的基因或片段，结合PCR、DNA测序等进行鉴定。

目前，常用于物种鉴定的目的基因主要有核基因如28S rRNA和非编码区序列（内含子）等，线粒体基因如Cyt b、12S rRNA、16S rRNA、D-loop基因片段^[17]等，由于mtDNA具有母系遗传、进化速率快、无组织特异性等特点，在将近一半的种属鉴别研究目标基因中，Cyt b占44%、12S rRNA占11%、16S rRNA 占8%、D-loop占8%^[18]。此外，线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚单位基因Ⅰ（cytochrome c oxidaseⅠ，COⅠ）也作为常用的线粒体分子标记，广泛应用于野生动物的种属鉴定，尤其是动物类药材的种属鉴定及其混伪品的鉴定^[19-20]。目前常用的DNA物种鉴定技术主要有DNA条形码、PCR-RFLP、物种特异性PCR、实时荧光PCR等。

2.2.1 DNA条形码

DNA条形码（DNA barcoding）是一种新兴的分子鉴定技术，DNA条形码所用的基因序列具有种属间的保守性、近缘物种间的特异性、易于扩增等特点，已广泛应用于野生动物及其制品鉴定。DNA条形码技术鉴定野生动物及其制品的主要流程为：样品采集→样品处理→核酸提取→DNA条形码筛选→PCR扩增→测序分析→物种鉴定。目前COⅠ序列的条形码具有操作简单、高效、不受检材生态特征的限制等优势，已成为公认DNA条形码^[21]，广泛适用于犀牛、穿山甲、海马、赛加羚羊、麝及禽类等濒危动物的鉴定中，基于16S rRNA、12S rRNA、Cyt b、D-Loop基因片段的DNA条形码也比较常见，适用于犀牛、穿山甲、马鹿、梅花鹿等的濒危动物鉴定^[22]。

在DNA条形码的使用过程中，根据DNA条形码片段长短不同，可将其分为标准条形码和微型条形码。标准条形码的片段为600～700 bp，其包含的核苷酸信息多，对物种的分辨率相对较高，适用于生鲜肉品、带毛囊的动物毛发等检材；微型条形码的片段为100～300 bp，其对核酸降解程度高的检材扩增效率高，适用于高温高压、物理化学复杂工艺处理的野生动物制品如皮革、动物胶等检材。因此，在实际应用过程中可根据不同检材、鉴定目标及条形码特点来选择合适的DNA条形码。

2.2.2 扩增片段限制性长度多态（PCR-RFLP）

PCR-RFLP技术是将PCR、RFLP分析与电泳方法相结合应用，其原理是先扩增某一段DNA，然后通过限制性内切酶对PCR扩增产物进行切割，产生长短不同的酶切片段，再由凝胶电泳将其进行区分，最后比较限制性图谱来分析序列之间的差异，可以用来鉴定物种^[23]。PCR-RFLP技术只需要少量的DNA就可以得到特异性较高的结果，无需昂贵的仪器，具有操作简单、快速、成本低、大通量等优势，现已被广泛应用于物种鉴定。目前通常扩增的是线粒体DNA的Cyt b和12S rRNA基因。严慧^[24]通过扩增家栖鼠的线粒体Cyt b基因，建立了基于PCR-RFLP的常见家栖鼠的快速鉴定方法，并成功应用于河北省各地市常见家栖鼠的种类鉴定。徐岩等^[25]建立了一种限制性片段长度多态性技术，能够对鹿茸真伪及种属进行快速、准确的鉴别，在中药易混品种的鉴定中有较好的应用前景。

2.2.3 物种特异性PCR

物种特异性PCR是基于PCR扩增和DNA序列分析的一种鉴定方法，主要原理是利用特异性引物扩增不同物种DNA，通过目的片段长度差别或扩增有无来鉴别物种。物种特异性PCR对检材需求量少，可同时鉴定多个物种，具有操作简便、经济、灵敏度高等优势，在动物类药材和野生动物刑事物证鉴定中有广泛的应用前景。该方法成功的关键在于物种特异性引物的设计，动物mtDNA上的Cyt b、12S rRNA基因在种内个体间的序列差异小，而种间的序列差异却较大，因此这两种基因是物种特异性引物的首选。李艳等^[26]基于Cyt b基因序列设计出1对特异性鉴别豹猫的引物组合PB-idF/PB-idR，建立了一种简便实用的豹猫物种多重PCR鉴定方法，该方法具有准确、高效等优点，在豹猫物种保护及执法工作中有较好的应用前景。

2.2.4 实时荧光PCR技术

实时荧光PCR的原理是在PCR体系中引入荧光信号，通过观察荧光扩增曲线进行判断，主要有TaqMan、SYBR GreenⅠ、分子信标、双杂交探针4种方法。该技术可以检测到不同肉类的微量样品，被认为是种属鉴别最有前景的分子生物技术之一^[27]，在肉类物种鉴定中已被广泛使用^[28]，文献报道了多种用于动物源性成分鉴定的实时荧光PCR方法，常见肉类、鱼类等的国家标准、农业行业标准等已发布。高明等^[29]建立了以线粒体D-loop基因为靶基因的一种基于TaqMan探针的实时荧光PCR，可应用于梅花鹿物种鉴别及食品中梅花鹿成分的快速鉴定。刘艳艳等^[30]以16S rRNA基因设计通用PCR引物和探针，建立了貂、狐狸、骆驼等8种动物毛纤维的多重实时荧光PCR方法进行物种鉴定研究。

2.2.5 微卫星DNA技术

微卫星DNA又称简单序列重复（simple sequence repeat，SSR），由于其具有多态性较高、共显性遗传、分布广泛、样品需求量少、操作简单、重复性好等优点，在濒危动物种群及保护遗传学研究中也发挥着越来越重要的作用。吴华等^[31]选用16个微卫星位点对我国4个野生梅花鹿种群的遗传多样性和遗传结构进行了分析，以期为我国野生梅花鹿的保护和管理提供科学依据。

3 结语

随着分子生物技术的不断发展，多种多样的DNA技术应用于物种鉴定，解决了形态鉴定等传统方法难以鉴定甚至不能鉴定的难题，但并不能取代传统鉴定方法，要做好野生动物及其制品的物种鉴定工作，可基于本文提到的各鉴定方法的优缺点（表1），根据不同的鉴定目的有效选择鉴定技术，使得野生动物及其制品的鉴定结果更加准确。目前用于野生动物及其制品的DNA物种鉴定技术仍存在不足之处：（1）缺乏动物物种鉴定的实验室及实验技术标准如样品采集（抽样问题）、DNA分型、数据分析等；（2）濒危野生动物的群体数据较匮乏，应尽快推进濒危动物DNA数据库的建设工作，以利于濒危动物的物种鉴定；（3）高效的DNA提取仍是DNA物种鉴定技术的难点，如实际工作中涉及的深加工处理或保存很久的制品，其DNA提取效率低；（4）应充分利用mtDNA的多态性，采用更多的DNA分子标记应用于濒危动物的鉴定；（5）目前DNA物种鉴定技术成本高，不利于基层普及，应向准确化、标准化、简单便捷、成本低的方向研究。

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第一作者：林萍萍（1987—），女，汉族，河北沧州人，硕士，兽医师，主要从事进出境动物疫病检疫研究，E-mail: weichen-lin@163.com

1. 黄骅港海关 沧州 061600

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