金文昕 李金庆

短体线虫（Pratylenchus，1936）寄主众多，包括小麦、玉米、烟草、花生等^[1]，能够侵染作物地下组织，造成组织腐烂坏死，进而影响作物的生长和产量，同时短体线虫造成的伤口也为病原真菌和细菌的侵染提供了便利^[2]。我国短体线虫种类主要包括落选短体线虫（Pratylenchus neglectus）、咖啡短体线虫（Pratylenchus coffeae）、斯克里布纳短体线虫（Pratylenchus scribneri）。其中，落选短体线虫在我国华东、华中及西北地区均有分布，是我国小麦种植地区的优势种群^[3]。小麦是此线虫的重要寄主，因此造成的损失严重，这给我国粮食生产安全带来严重的潜在威胁。

短体线虫种类之间在形态学鉴定上较为困难且存在种内变异现象，当样品中存在多种短体线虫时，若以形态特征鉴定极容易产生误判^[4]。基于PCR、实时荧光定量PCR的PCR-RAPD、PCR-RFLP、PCR-SSCP等检测方法虽然准确率高，但存在耗时长、操作复杂、设备要求高等限制因素^[5-9]；基于LAMP技术的检测方法存在无法进行多种线虫扩增、假阳性率高等缺点^[10]。因此，建立一种快速、准确、灵敏、简便的落选短体线虫检测方法对该线虫的鉴定、诊断及检验检疫具有重要意义。

本研究采用基于变性泡介导的链交换恒温扩增（Strand Exchange Amplification，SEA）技术对落选短体线虫进行快速检测，该技术的基本原理是SEA的引物通过侵入DNA“呼吸”作用引起的变性泡结构，在聚合酶的作用下延伸并置换下原有的互补链来形成指数式扩增^[11]。参照王熊等^[12]的研究，采用改进后的热裂解法加速核酸释放，反应前加入SEA比色染料即可实现扩增结果的肉眼判定。

1 材料与方法

1.1 线虫的采集与鉴定

落选短体线虫（Pratylenchus neglectus）、咖啡短体线虫（Pratylenchus coffeae）、斯克里布纳短体线虫（Pratylenchus scribneri）样本采集地信息见表1。采用浅盘法分离各样本中的线虫，以各样本中单条短体线虫DNA为模板，以通用引物JB3(5'-TTTTTTGGGCATCCTGAGTAT-3')和JB5(5'-AGCACCTAAACTTAAAACATAATGAAA TG-3')进行mtDNA-COⅠ片段的扩增，每个样本5次重复。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序。在GenBank中搜索并下载与测序得到的片段相似度高的序列，使用BioEdit进行序列比对分析，结果见表1。

1.2 试剂和仪器设备

20×Eva Green由上海懋康生物科技有限公司提供；20×液相RNase去除剂由北京索莱宝科技有限公司提供；TaqPCR master mix由新贝（上海）生物科技有限公司提供；SEA恒温扩增试剂盒由青岛耐德生物科技有限公司提供；恒温扩增荧光检测系统UMG-1600由杭州优米仪器有限公司提供；恒温金属浴TU-10由上海一恒科学仪器有限公司提供。

1.3 落选短体线虫SEA特异性引物设计

在GenBank中分别搜索落选短体线虫（Pratylenchus neglectus）、咖啡短体线虫（Pratylenchus coffeae）、斯克里布纳短体线虫（Pratylenchus scribneri）的28S rDNA序列，使用BioEdit进行序列比对分析，使用Primer Premier 5软件设计落选短体线虫SEA特异性引物SPN-1和SPN-2（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 热裂解法提取DNA

参照王熊等^[12]的研究，使用热裂解法提取落选短体线虫样品核酸，具体操作如下：显微镜下用微量移液枪吸取含10条落选短体线虫LX2-1的悬浮液4.5 μL加入到0.5 mL的PCR管中，加入5 μL WLB裂解液（125 mmol·L^-1 KCl，25 mmol·L^-1 Tirs-HCl pH 8.3，3.75 mol·L^-1 MgCl₂，2.5 mmol·L^-1 DTT，质量分数1.125%的Tween 20），加入0.5 μL的20×液相RNase去除剂，混合均匀，95℃处理5 min后，落选短体线虫裂解液作为扩增模板。

1.5 落选短体线虫SEA扩增体系的建立

按照SEA恒温扩增试剂盒使用说明，SEA比色法扩增体系总体积10 μL，包括2×reaction mix 5 μL，正反向引物（1.5×10^-6 mol·L^-1）各0.15 μL，扩增模板3 μL，20×Eva Green 1 μL，加水补至10 μL，以等量ddH₂O为模板作为空白对照。61℃下在恒温扩增荧光检测系统上进行实时荧光监测。为了实现检测结果肉眼可视化过程，可将Eva Green替换为SEA比色染料，以等量ddH₂O为模板作为空白对照，61℃下在恒温金属浴进行扩增反应。结束后反应体系呈浅黄色为阴性，呈红色为阳性。

1.6 落选短体线虫SEA扩增体系灵敏度及特异性验证

取用热裂解法提取的落选短体线虫LX2-1扩增模板3 μL、1.5 μL、0.5 μL、0.3 μL，分别加入1.5 μL的SEA恒温扩增体系中，以ddH₂O为模板作为空白对照。在恒温扩增荧光检测系统上实时监测荧光信号变化，验证落选短体线虫SEA恒温扩增体系灵敏度。

按照1.4的方法分别提取落选短体线虫LX2-1、咖啡短体线虫QS2-1、斯克里布纳短体线虫LS1-1DNA为模板，以SPN-1和SPN-2为正反向引物，按照1.5的方法分别用SEA恒温体系扩增，以等量ddH₂O为模板作为空白对照，验证落选短体线虫特异性。

2 结果与分析

2.1 热裂解法在落选短体线虫SEA扩增体系中的验证

由图1可知，以落选短体线虫裂解液作为扩增模板的SEA恒温扩增体系在34 min即可检测到荧光信号，在47 min荧光信号不再增强，而对照实验始终未检测到荧光信号。说明SEA方法可以检测落选短体线虫，且改进后的热裂解法提取落选短体线虫DNA在SEA恒温扩增体系中是可靠的。热裂解法大幅缩短了DNA提取及检测时间，简化 了检测流程，可在检测其他线虫工作中试验应用。

图1 热裂解法在落选短体线虫SEA扩增体系中的验证

Fig.1 Validation of pyrolysis method in SEA amplification system of P. neglectus

2.2 落选短体线虫SEA扩增体系灵敏度验证

分别将3 μL、1.5 μL、0.5 μL、0.3 μL落选短体线虫的DNA、ddH₂O为扩增模板加入SEA恒温扩增体系后，由图2可知，3种剂量的落选短体线虫扩增模板在SEA恒温扩增体系中均能检测到荧光信号，检测到信号的时间随剂量的减少而延迟，0.5 μL落选短体线虫扩增模板在52 min检测到荧光信号，0.3 μL落选短体线虫扩增模板虽然在58 min检测到荧光信号，但强度微弱，且未形成指数增强。因热裂解法体系体积为10 μL，其中含有10条落选短体线虫的核酸含量。因此，0.5 μL扩增模板相当于0.5条落选短体线虫的核酸含量，这表明SEA恒温扩增体系对落选短体线虫扩增的灵敏度高，可用于检测单条落选短体线虫。

图2 落选短体线虫SEA扩增体系灵敏度

Fig.2 Sensitivity of SEA amplification system of P. neglectus

2.3 落选短体线虫SEA扩增体系特异性验证

分别以落选短体线虫、咖啡短体线虫、斯克里布纳短体线虫DNA为模板，以SPN-1和SPN-2为正反向引物在SEA恒温体系中扩增。由图3可知，仅以落选短体线虫的DNA为模板的SEA体系呈现荧光信号，以咖啡短体线虫、斯克里布纳短体线虫DNA、ddH₂O为模板的SEA体系均未呈现荧光信号，表明SEA恒温扩增体系可以区分落选短体线虫与咖啡短体线虫、斯克里布纳短体线虫，特异性良好。

图3 落选短体线虫SEA扩增体系特异性

Fig.3 Specificity of SEA amplification system of P. neglectus

2.4 落选短体线虫SEA扩增体系可视化验证

如图4所示，将Eva Green替换为SEA比色染料后，以落选短体线虫的DNA为模板的SEA体系呈红色，为阳性；以咖啡短体线虫、斯克里布纳短体线虫的DNA、ddH₂O为模板的SEA体系均呈淡黄色，为阴性。说明SEA比色染料在SEA恒温扩增体系中可靠性良好，在条件受限情况下可通过颜色 变化判定实验结果。

图4 可视化检测落选短体线虫SEA扩增体系

Fig.4 Visualized detection SEA amplification system of

P. neglectus

3 讨论

落选短体线虫在我国分布广泛，是我国重要的危害小麦根部的线虫^[13]，快速检测研究对该线虫的诊断、防治及口岸检验检疫具有积极意义。本研究采用的热裂解法提取落选短体线虫核酸，摆脱了提取DNA对高速离心机等仪器的依赖，在免去反复清洗冷冻、蛋白酶解等烦琐提取步骤的基础上，将提取时间由大约2 h缩短至10 min左右，极大地提高了提取效率。经验证，该方法在落选短体线虫SEA扩增体系中稳定可靠，可在条件、时间受限环境下试验应用，比较适合海关各口岸初筛实验室使用。SEA恒温扩增体系在引物浓度1.5×10^-6 mol·L^-1、61℃条件下可检测0.5条落选短体线虫的核酸含量，且能有效区分落选短体线虫与咖啡短体线虫、斯克里布纳短体线虫，从挑取线虫到反应结束耗时1 h左右。

刘锐^[14]的研究表明，变性泡介导的链交换扩增方法在猪肉掺假检测及电场辅助核酸预处理中表现出良好的稳定性及特异性。刘彩艳^[15]采用变性泡介导的链交换扩增方法检测牛肉、猪肉等样品中金黄色葡萄球菌的阳性率，结果表明该方法与传统的培养方法阳性率一致，但用时更短，设备要求更低。本研究首次将SEA恒温扩增体系应用于落选短体线虫的快速检测，结果表明，落选短体线虫SEA恒温扩增体系对设备要求低，反应时间短，灵敏度和特异性良好，在没有恒温荧光检测条件下，SEA比色染料可肉眼判定反应结果。由此可见，该方法在基层和口岸检疫等单位的鉴定、检测等方面应用前景广阔。

虽然本研究验证了SEA恒温扩增体系在落选短体线虫检测上的诸多优势，但由于SEA扩增体系引物筛选较为困难且无法应用于高通量检测平台等限制因素，目前在基础研究中应用较少。邓杰^[16]系统研究了SEA恒温扩增体系的引物设计原则及将SEA与微流控芯片结合打造出高通量检测平台的可能性，这将有力地推动SEA恒温扩增体系更广泛的应用。

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基金项目：海关总署科研项目（QK202016）

第一作者：金文昕（1974—），女，汉族，江苏苏州人，学士，主要从事海关进出口贸易监管，E-mail: 23411419@qq.com

通信作者：李金庆（1982—），男，汉族，山东安丘人，硕士，高级农艺师，主要从事植物检疫，E-mail: 95232596@qq.com

1. 烟台海关 烟台 264000

2. 烟台海关技术中心 烟台 264000

1. Yantai Customs, Yantai 264000

2. Yantai Customs Technology Center, Yantai 264000