王仲敏 宋 喆 吴冬雪 王乃福 赵 宏 赵良娟 高旗利

产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）为革兰氏阴性球杆菌，具荚膜、菌毛，无鞭毛，兼性厌氧^[1]，肠杆菌科克雷伯氏菌属的一个种，是一种重要的条件致病菌^[2-3]。婴儿由于免疫系统发育不健全，免疫力相对低下，为易感人群，一旦感染产酸克雷伯氏菌，可侵染呼吸、血液、腹腔和中枢神经系统^[4-5]，从而引发肠胃炎、腹泻合并食物中毒症状^[6-7]。调查报告表明，婴儿配方奶粉中被该菌污染的概率为2.8%^[8]，FAO/WHO于2004年婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌和其他微生物的联席会议上，将产酸克雷伯氏菌列为婴儿配方奶粉中的致病病原菌，要求各成员国实施有效的监控措施，保障婴儿配方奶粉安全哺喂婴儿。目前婴儿配方奶粉中产酸克雷伯氏菌的检测为传统方法^[9]，本文通过研究产酸克雷伯氏菌的半乳糖醛酸酶基因，探索通过实时荧光PCR的方法，实现婴儿配方奶粉中产酸克雷伯氏菌快速精准检测。

1 材料

1.1 培养基及生化试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、营养肉汤（北京陆桥技术有限责任公司）；多聚半乳糖醛酸钠（Sigma公司，CAS 9049-37-0）；细菌全基因组DNA提取试剂盒(北京天为时代科技有限公司)；特异引物及TaqMan探针（上海生工）。

1.2 仪器

ABI PRISM 7000荧光PCR扩增仪(ABI，American) ；离心机（Eppendorf，5417R，Germany）。

1.3 供试菌株

实验共选用24株供试菌株，自备菌株为本实验室分离或友情实验室赠送，业经鉴定，见表1。

2 方法

2.1 供试菌株复苏

所有实验菌株接种于营养肉汤，37℃过夜培养，菌浓度应为10⁸～10⁹ CFU/mL。

2.2 产酸克雷伯氏菌多聚半乳糖醛酸酶实验

利用细菌多聚半乳糖醛酸酶的特性^[10]，用接种针点种已复苏的ATCC 49473、ATCC 49334、ATCC 700324、上海CDC总69-88及K.oxy50914于多聚半乳糖醛酸盐半固体琼脂平板（0.6 mL 10% CaCl₂、1.0 mL 0.1% 溴百里蓝、0.5 g酵母浸出液、3 g聚半乳糖醛酸钠、0.3 g琼脂、100 mL蒸馏水 pH 7.3），37℃下，培养48～72 h，肺炎克雷伯氏菌ACCC 10084作阴性对照。

2.3 细菌全基因组DNA提取

取1.5 mL过夜菌悬液，用细菌全基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，将细菌DNA溶于50 µL TE中，-20℃保存。

2.4 荧光PCR引物和探针的设计和筛选

根据产酸克雷伯氏菌VN13多聚半乳糖醛酸酶基因（accession AY065648）^[11]，使用Primer Express 3.0软件设计特异引物及TaqMan探针，经评估实验后，筛选出一对特异性较好的引物及TaqMan探针，目标序列长度约为170 bp。引物/探针序列为F：5'-TACCGTCACGCACTATCCTC-3'；R：5'-GCGGATACTGGGCCGGA-3'；P：FAM-GG CGCGTTGTTCCTGCACAG-BHQ1。

2.5 反应体系和反应条件

反应体系为25 μL ，其中2×Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L）和探针0.5 μL（10 μmol/L），模板DNA 1 μL。

反应条件为95℃预变性10 min；95℃变性15 S，62℃ 50 S，40个循环。

2.6 特异性实验

复苏产酸克雷伯氏菌ATCC 49473、ATCC 49334、ATCC 700324、总69-88、K.oxy50914、K.oxy51107，以及阪崎肠杆菌ATCC 29544、阴沟肠杆菌CMCC 45301、肠炎沙门氏菌CMCC 50041、大肠杆菌ATCC 8739、团聚肠杆菌DG1、粘质沙雷氏菌NSL1、鼻炎克雷伯氏菌CMCC 46110、产气肠杆菌CMCC 45103、鼻硬结克雷伯氏菌CMCC 46116，按2.2所述方法提取细菌DNA，进行实时荧光PCR检测。

2.7 灵敏度实验

2.7.1 样品增菌及增菌液细菌DNA提取

取100 g经传统方法^[12]检测未污染产酸克雷伯氏菌的婴儿配方奶粉，溶于900 mL LST中混匀，37℃培养22～24 h，然后按2.2所述方法提取细菌DNA。

2.7.2 婴儿配方奶粉中产酸克雷伯氏菌检测灵敏度

婴儿配方奶粉样品设A、B两个重复，在增菌前分别添加产酸克雷伯氏ATCC 49473（2.5 CFU/100 g、25 CFU/100 g），按2.6.1所述方法进行增菌并提取增菌液中细菌DNA，进行实时荧光PCR检测，以未添菌A、B样品作空白对照。

3 结果

3.1 产酸克雷伯氏菌多聚半乳糖醛酸酶实验结果

图1为产酸克雷伯氏菌多聚半乳糖醛酸酶实验结果。菌落1为肺炎克雷伯氏菌ACCC 10084，菌落2～6分别为产酸克雷伯氏菌ATCC 49473、ATCC 49334、ATCC 700324、总69-88及K.oxy50914。从图中可以看出，除肺炎克雷伯氏菌ACCC 10084外，产酸克雷伯氏菌都形成了凹陷菌落，说明该菌多聚半乳糖醛酸酶阳性，具有多聚半乳糖醛酸酶基因。

图1 菌株培养实验

Fig.1 Strain culture test

3.2 引物探针特异性实验结果

图2为引物探针特异性实验结果。从图中可以看出，出现了6条特异性扩增曲线，1～6分别为产酸克雷伯氏菌ATCC 49473、ATCC 49334、ATCC 700324、总69-88、K.oxy50914及K.oxy51107，而阪崎肠杆菌ATCC 29544、阴沟肠杆菌CMCC 45301、肠炎沙门氏菌CMCC 50041、大肠杆菌ATCC 8739、团聚肠杆菌DG1、粘质沙雷氏菌NSL1、鼻炎克雷伯氏菌CMCC 46110、产气肠杆菌CMCC 45103、鼻硬结克雷伯氏菌CMCC 46116及肺炎克雷伯氏菌ACCC 10084都没有特异扩增曲线。本组引物探针具有很好的检测特异性。

图2 引物特异性实验

Fig.2 Primer probe specificity test

图3 检测灵敏度试验

Fig.3 Detection sensitivity test

3.3 灵敏度实验结果

图3为婴儿配方奶粉中产酸克雷伯氏菌检测灵敏度实验结果。从图中可以看出，P为阳性对照，Ct值为18；25A、25B为添菌量为25 CFU/100 g的A、B样品，其Ct值在21附近；2.5A、2.5B为添菌量为2.5 CFU/100 g的A、B样品，其Ct值在27附近。灵敏度实验结果表明，本文建立的实时荧光PCR检测方法的检测低限可达到10⁰ CFU/100 g数量级。

4 结论与讨论

现阶段食品中产酸克雷伯氏菌的检测还没有分子生物学方法，现行标准方法采用传统的分离培养法，不仅检测周期长，而且选择性差，会出现漏检现象。为弥补文献方法的局限性，本文根据产酸克雷伯氏菌多聚半乳糖醛酸酶基因设计并筛选出一对实时荧光PCR引物及TaqMan探针，建立婴儿配方奶粉中产酸克雷伯氏菌实时荧光PCR检测方法。实验结果表明，所建立的实时荧光PCR检测方法不仅特异性好，而且灵敏度高，检测低限可达到10⁰ CFU/100 g数量级，并使检测流程缩短至2 d。

在增菌方法中，本文采用了大肠菌群MPN计数培养基LST^[12]，称取无菌婴儿配方奶粉样品100 g溶于900 mL LST中，37℃，增菌22～24 h，经评估其增菌效果良好。添菌实验表明，产酸克雷伯氏菌在婴儿配方奶粉中含量为10⁰ CFU/100g数量级时，经LST增菌后，增菌液中的浓度可到达（10⁵～10⁶）CFU/mL数量级，完全可以满足荧光PCR检测低限的需要；在提取细菌DNA时，要尽量吸取澄清液，避免吸入奶块，影响DNA的提取效果；经实验比较后，本文建议采用离心柱法提取DNA，相比酚氯仿法，该法所提取的DNA纯度和浓度更高。因此，本文所述实时荧光PCR方法可用于婴儿配方奶粉中产酸克雷伯氏菌的检测。

参考文献

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基金项目：天津海关科研项目（2020THK007）

第一作者：王仲敏（1983—），男，汉族，山东济南人，硕士，高级农艺师，主要从事植物检疫及分子生物学研究，E-mail: wzm2112@163.com

通信作者：高旗利（1964—），男，汉族，天津人，硕士，研究员，主要从事食品微生物检测及研究工作，E-mail: gaoqltjciq@163.com

1. 天津海关动植物与食品检测中心 天津 300041

1. Animal, Plant and Foodstuff Inspection Center, Tianjin Customs, Tianjin 300041