王丽梅 张敏爱 耿昱琨 巩红霞 薛亚琴 卫鹏宇

如今，随着渔业的发展，海鲜类产品已经在市场上广为流通，人们也因生活水平的提高而增加了对该类产品的需求，而副溶血性弧菌作为一种在沿海地区常见的食源性致病菌，引起的食物中毒事件也在国内外多地逐年发生^[1]。据相关数据统计，在某些沿海城市由副溶血性弧菌引起的食物中毒高达60%以上，是我国首要的食源性致病菌^[2]。因此，副溶血性弧菌检验是保证水产食品安全的关键环节^[3]。

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus，VP）是一种海洋细菌，存在于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等水产品。食入含有该菌浓度达到10⁶ CFU/mL(g)的食物可导致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒，其潜伏期为2～26 h^[4]，临床上表现为急性起病、腹痛、呕吐、腹泻以及水样便等症状。

能力验证是通过实验室之间相比对来确定实验室能力的一种活动，实质上是为了确保实验室能够维持较高的检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动，也是实验室内部质量控制的一种有效方式。实验室通过参加能力验证，能够对其质量控制情况和实验室人员水平技能进行考核和判定，提高检测人员的检测水平，确保提供的检测数据具有可靠性和有效性^[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待测样品

ACAS-PT1096（2021）食品中副溶血性弧菌（定性）检测能力验证样品2个，其编号分别为S073和R813，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供。

1.1.2 菌株

CICC 21617 副溶血弧菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的标准菌株（阳性对照）。

1.1.3 培养基及试剂

营养肉汤，3%氯化钠碱性蛋白胨水，硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂，3%氯化钠胰蛋白胨大豆（TSA）琼脂，氧化酶试剂，革兰氏染液试剂盒，3%氯化钠三糖铁琼脂，不同氯化钠浓度（0%、6%、8%和10%）的胰胨水，副溶血性弧菌干制生化鉴定试剂盒，均购自北京陆桥技术股份有限公司；科玛嘉弧菌显色培养基，购自上海欣中生物工程有限公司；VITEK2 革兰氏阴性细菌鉴定GN卡，购自法国生物梅里埃公司；副溶血性弧菌核酸检测试剂盒，购自深圳生科原生物有限公司。

1.1.4 仪器设备

隔水式培养箱（上海博讯），电子显微镜（德国蔡司），全自动微生物生化鉴定系统VITEK2-Compact（法国梅里埃），荧光PCR仪（美国应用生物系统公司）。

1.2 检验方法

按照ACAS-PT1096（2021）食品中副溶血性弧菌（定性）检测能力验证参试指导书和《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》（GB 4789.7-2013）进行检验，操作步骤包括样品制备、增菌、分离、纯培养、生化鉴定试验、全自动微生物生化鉴定系统以及荧光PCR法，具体检验程序如图1所示。

图1 副溶血性弧菌检验流程

Fig.1 Test procedure of Vibrio parahaemolyticus

1.2.1 样品制备

首先将装有样品的西林瓶在生物安全柜中用酒精棉擦拭，样品开启后，按照ACAS-PT1096（2021）食品中副溶血性弧菌（定性）检测能力验证参试指导书中样品处理方法，将样品制成待测样品原液，编号分别为S073和R813。

1.2.2 样品增菌、分离和纯培养

按照GB 4789.7-2013中定性检测方法步骤对样品S073和R813进行增菌、分离和纯培养。样品在增菌时，需将副溶血性弧菌的标准菌株CICC 21617用营养肉汤活化做阳性对照，其余步骤中标准菌株CICC 21617和样品同步操作。

1.2.3 样品生化鉴定

挑取18～24 h新鲜纯培养物进行革兰氏染色、镜检，同时进行手工生化试验（氧化酶试验、3%氯化钠三糖铁试验以及嗜盐性试验）和副溶血性弧菌干制生化鉴定试剂盒对样品菌种鉴定。此外，为确保结果的准确性，还挑取了纯培养物使用VITEK2 革兰氏阴性细菌鉴定GN卡通过全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）鉴定。

1.2.4 荧光PCR试验

本次采用副溶血性弧菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）提取DNA，提取了能力验证样本核酸以及标准菌株CICC 21617的样本核酸，DNA提取操作步骤及荧光PCR操作步骤均按照核酸检测试剂盒说明书进行。将提取出的样品DNA模板0.5 µL与副溶通用PCR反应液19.5 µL和副溶通用混合酶液0.5 µL混合成25 µL的反应体系。按照50℃ 2 min，95℃ 3 min，95℃ 5 s，55℃ 60 s，循环40次的扩增参数进行扩增。上述副溶通用PCR反应液和副溶通用混合酶液以及扩增参数均来自购买的试剂盒。

2 结果与分析

2.1 增菌与菌落分离结果

样品R813和S073以及标准菌株的增菌结果和菌落分离结果如表1所示。TCBS平板的“＋”结果：菌落呈圆形斗笠状，半透明，表面光滑为绿色，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2～3 mm。弧菌显色培养基平板的“＋”结果：菌落呈圆形斗笠状，菌落为淡紫色。

表1 增菌与菌落分离结果

Table 1 Results of bacterial growth and separation

注：表中“-”为阴性结果，“+”为有阳性结果

2.2 生化鉴定结果

从编号为R813的TCBS琼脂平板和弧菌显色培养基平板上各取2个典型菌落进行纯培养，分别编号为R813-1、R813-2、R813-3、R813-4，同时连带标准菌株用新鲜纯培养物进行生化试验，结果如表2所示。

氧化酶试验的“＋”结果：用接种环从单个菌落的纯培养平板上挑取一点菌落置于无菌滤纸，滴加氧化酶试剂，1 min内变为蓝色。3%氯化钠三糖铁琼脂的“＋”结果：3%氯化钠三糖铁琼脂底层变黄不变黑，斜面颜色红色加深，无气孔产生。3%氯化钠半固体的“＋”结果：3%氯化钠半固体沿穿刺线扩散生长，周围呈红色雾状。嗜盐性试验的“＋”结果：自制的试管中胰冻水溶液轻微变浑浊，呈现弱阳性，结果不典型；干制生化鉴定试剂盒中颜色变红色。嗜盐性试验的“-”结果：自制的试管中胰冻水溶液不变（澄清）；干制生化鉴定试剂盒中颜色不变（无色）。葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘露醇的“＋”结果为黄色，“-”结果为绿色。赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸的“＋”结果为紫色，“-”结果为黄色。V-P的“-”结果不变色（黄色浑浊）。ONPG的“-”结果为无色。

2.3 全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）鉴定结果

对样品R813及标准菌株选取菌落使用全自动微生物生化鉴定系统鉴定，结果如表3所示。

表3 全自动微生物生化鉴定系统试验结果

Table 3 Test results of automatic microbial biochemical identification system

使用VITEK2 全自动微生物生化鉴定系统鉴定时，选择纯化的单个菌落，通过比浊仪制成麦氏浊度为0.6左右的菌悬液，放入GN鉴定卡鉴定。鉴定结果都是副溶血性弧菌，且结果符合率都在90%以上。

2.4 PCR检测结果

荧光PCR法检测结果如图2所示。结果显示：编号为R813的样品1、2、3、4和标准菌株CICC 21617的1、2，FAM检测通道Ct值≤36，且有明显指数增长；阳性质控品Ct值≤30，有明显指数增长；阴性质控品和空白对照无Ct值，线形为轻微斜线，依据试剂盒说明书的结果判定，样品中检测出副溶血性弧菌。阳性质控品和阴性质控品均由试剂盒中提供，空白对照用无菌水替代DAN模板。

3 讨论与结论

在手工生化试验中，嗜盐性试验结果在6%和8%盐胨水中应该生长旺盛，但在实际结果中却没有显示出明显的生长状况，其他生化鉴定套装、VITEK2-compact鉴定系统和荧光PCR结果良好，都呈现明显的阳性结果。嗜盐性试验结果不明显，一方面可能由于微生物的不确定性及微生物个体的差异性发生的偶然现象，引起的嗜盐性试验结果不明显；另一方面可能与手工试验的培养基的量有关，标准要求接种纯培养的单个菌落至不同氯化钠浓度的胰胨水中，但标准中并未说明这些培养基的量，在同样的培养条件下一个单菌落接种至200 µL培养基和接种至6 mL培养基（本次试验中手工嗜盐性试验用的培养基量为6 mL，而生化鉴定套装中的培养基量为200 µL）最终浊度是有区别的。此外，查阅文献发现，郭昌华等^[6]在一次参加食品中副溶血性弧菌能力验证的嗜盐性试验时就出现了假阳性结果。因此，在副溶血性弧菌检测过程中，不能仅依据手工生化试验来直接判定是否有该菌检出，还需要增加VITEK2-compact鉴定系统和荧光PCR结果来综合分析确定，以防误检漏检。

在完成能力验证实验后，对确定菌种保存也是关键一环。分离得到一株优良的菌株并且保存好，可以作为实验室的阳性对照菌株使用，也可以用于类似的科研项目。刘国刚等^[7]经对副溶血性弧菌4种保存方法3个月存活情况比较发现：-70℃冻干保存存活率高达83%，是保存效果最好的一种方法。杨胜远等^[8]就副溶血性弧菌保存条件进行研究发现：将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培养基培养后，可将其直接放置于4℃保藏，时间可达90 d，活细胞数也仅从10⁹下降到10⁶。上述两种方法均可以有效保存副溶血性弧菌。本实验室采用-80℃冷冻冰箱保存菌株，但要注意-80℃冷冻冰箱虽然可以抑制菌的代谢，在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，但不建议反复冻融。

本次参加食品中副溶血性弧菌（定性）检测能力验证，通过生化试验和VITEK2-Compact系统鉴定，最后采用实时荧光PCR进行确证，样品R813中检出副溶血性弧菌，样品S073中未检出，结果评价为满意。此次能力验证活动，不仅提升了实验室检验人员对副溶血性弧菌的检测能力，同时也提高了实验室的竞争力，可以为以后副溶血性弧菌能力验证和日常食品检验提供帮助和指导^[9]，保障实验室更好发展。

参考文献

[1] 刘娜, 赵琳娜, 王学硕, 等. 食品检测用副溶血性弧菌标准物质的制备和评价[J]. 现代食品科技, 2021, 37(11): 348-353. 

[2] 张金金, 扈庆华, 李连青. 副溶血弧菌的致病性及检测方法[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2014, 6(4): 274-278.

[3] 毕水莲, 罗永文, 关小莺. PCR衍生技术快速检测副溶血弧菌的研究进展[J]. 江西农业学报, 2017, 29(8): 105-109.

[4] 刘小青, 严琼英, 陈国培, 等. RPA等温扩增技术检测副溶血性弧菌[J]. 食品工业科技, 2020, 41(1): 112-118.

[5] 杨穗珊, 谢作蓉, 林宝英. 食品中副溶血性弧菌检测能力验证分析[J]. 现代食品, 2018(11): 91-93.

[6] 郭昌华, 陆贞玉, 李红梅, 等. 食品中副溶血性弧菌检测能力验证结果分析[J]. 应用预防医学, 2013, 19(1): 58-59.

[7] 刘国刚, 陈明环, 王庆忠, 等. 副溶血性弧菌在自然界及实验条件下存活相关因素分析[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(12): 3505+3507.

[8] 杨胜远, 韦锦, 李卓文, 等. 副溶血性弧菌保藏条件研究[J]. 湖北农业科学, 2014, 53(18): 4395-4398.

[9] 范鹏飞, 顾春华, 杨陶丽薇, 等. 副溶血性弧菌能力验证及分析[J]. 中国食品, 2021(18): 99-101