陈 闯 夏于林 黄冬地

2021年，国家市场监督管理总局发布了新修订的饮料酒、白酒相关国家标准，重新明确了白酒的定义，其中最大的一个变化在于规定了白酒“不直接或间接添加非自身发酵产生的呈色呈香呈味物质”，即不得添加食品添加剂，若添加了食品添加剂，则只能称为配制酒或调香白酒^[1-2]。根据近年来国家开展的白酒专项监督抽检结果显示，在白酒中违规添加甜味剂的问题依然突出，不仅对消费者身体健康造成了伤害，也扰乱了白酒生产销售市场^[3-4]。

纽甜，甜度是蔗糖的7000～13000倍，是阿斯巴甜的30～60倍，因其具有甜味纯正、清新自然、安全性较高、添加量少等特性，是白酒中常见的违规甜味添加剂^[5-6]。

依据相关标准要求，开展检测的实验室应评定测量不确定度，当测量不确定度与测定结果的有效性和应用相关，或不确定度影响到对规范限定的符合性时，应给出符合规定的不确定度^[7]。本文使用相比于常规液相色谱检测法更灵敏、检测限更低的超高效液相色谱-串联质谱法对白酒中纽甜含量进行测定^[8-9]，并根据评定不确定度的相关标准、规范进行分析，从而识别白酒中纽甜含量不确定度的来源及影响因素，进而加强实验室检测过程中的操作控制，提高实验室测定白酒中纽甜含量的准确性、可靠性。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及耗材

色谱质谱联用仪（安捷伦三重四级杆液相色谱质谱联用仪1200＋6410ESI，美国安捷伦公司）；XDB-C₁₈色谱柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm，美国安捷伦公司）；电子天平（XS105 DualRange，瑞士梅特勒-托利公司）；MIMI-Q A10超纯水仪（美国密理博公司）；吸量管及容量瓶（A级）。

添加纽甜的白酒样品；纽甜标准物质（Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥98%）；乙酸（色谱纯，科密欧化学试剂有限公司）；水相过滤膜（0.45 μm，津腾公司）；乙腈（色谱纯，美国天地化学试剂公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

白酒样品经0.45 μm水相滤膜过滤至进样瓶，供超高效液相色谱-串联质谱测定。

1.2.2 标准曲线工作溶液的配制

纽甜标准物质纯度为98%，用电子天平准确称取标准物质102.04 mg，使用超纯水溶解并定容于100 mL容量瓶中，得到100 μg/mL纽甜储备液；使用1 mL吸量管吸取1 mL纽甜储备液至100 mL容量瓶中，用超纯水定容，稀释成1 μg/mL纽甜中间液；再使用0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL分度吸量管，分别吸取纽甜中间液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL、3.2 mL至5支10 mL容量瓶中，用超纯水定容。由以上操作可分别配置成20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、320 μg/L的纽甜标准曲线工作溶液系列。

1.2.3 UPLC-MS/MS工作条件

液相参数：0.1%乙酸＋乙腈（65:35，v/v）；流动相流速0.5 mL/min；样品进样量5 μL；柱温30℃。

质谱参数：电喷雾源（ESI）；采用NEG模式扫描；倍增管电压增量DELTA EMV（-）200 V；气体温度350℃；气体流量11 L/min；雾化压力35 psi；毛细管电压-4000 V；质谱温度100℃。

1.3 数学模型

白酒中纽甜含量的计算公式如下：

(1)

式（1）中，X为白酒样品中纽甜含量，μg/L；X₁是从标准曲线工作溶液拟合的线性回归方程中计算得到的白酒样品中纽甜含量，μg/L；V₁是白酒样品稀释后的体积，mL；V是白酒样品体积，mL。本次白酒样品中纽甜含量经过初检，其含量在标准曲线工作溶液浓度的线性范围内，故白酒样品未经稀释。

2 评价与合成不确定度

2.1 分析不确定度的来源

从标准曲线工作溶液配制、样品进样测定、仪器计算过程与数学模型分析，主要不确定度来源包括：标准物质纯度及称量过程，标准曲线工作溶液定容和稀释过程，样品重复测量过程，线性回归方程拟合，回收率的测量^[10-11]。

2.2 不确定度分量的评价

2.2.1 标准物质纯度引入的相对标准不确定度U_1rel

标准物质纯度属于潜在的不确定度，根据制造商证书提供的数据，纽甜标准物质的纯度为98%±0.2%，考虑采用矩形分布k＝，则由标准物质纯度引入相对标准不确定度为

U_1rel0.00118 (2)

2.2.2 标准物质称量引入的相对标准不确定度U_2rel

天平的称量考虑天平的最小分辨率、线性引入的不确定度^[12]。本次称量使用的天平最小分辨率为0.01 mg，分辨率误差半宽区间为±0.005 mg，根据不确定度评定规则，假设矩形分布k＝，则最小分辨率产生的不确定分量为

U_2.10.00289 mg (3)

根据天平校准证书，该天平称量范围在0～5 g时，其线性误差为±0.05 mg，假设矩形分布k＝，则线性不确定度分量为

U_2.20.0289 mg (4)

由于称重时采用差减法，共有2次称量，1次作为空盘，1次作为总重，2次为独立不相关的观察结果，所以由称量引入的标准不确定度为

U₂0.04107 mg (5)

配置标准曲线工作溶液时，称取纽甜标准物质102.04 mg，因此由称量引入的相对标准不确定度为

U_2rel0.00040 (6)

2.2.3 标准曲线工作溶液定容与稀释引入的相对标准不确定度U_3rel

根据1.2.2所述，标准曲线工作溶液配制过程涉及多次定容、移液、稀释，需使用不同规格的容量瓶和吸量管，因此考虑玻璃量具的校准和温差变化引入的标准不确定度^[13]。

（1）校准引入的标准不确定度。各玻璃量具校准引入的标准不确定度根据其在20℃时的容量允差d^[14]，考虑采用矩形分布k＝，则校准引入的标准不确定度为

(7)

（2）温差变化引入的标准不确定度。根据校准规程，各玻璃量具在20℃进行校准，考虑到实验室温度变化，设定温度在（20±4）℃之间变动，则温差变化值＝4，已知水体积膨胀系数F＝2.1×10^-4/℃，量具的使用体积V，考虑采用矩形分布k＝，则温差变化引入的标准不确定度为

(8)

1.2.2所述中玻璃量具的各影响数据及不确定度计算值见表1，故由配置标准曲线工作溶液定容与稀释引入的相对标准不确定度为

U_3rel＝

＝0.01896 (9)

2.2.4 样品重复测量的相对标准不确定度U_4rel

在整个实验过程中，考虑样品进样和仪器测定的重复性，在同一个实验条件下平行测定样品8次（N＝8），测定结果X_i分别是51.1 μg/L、45.2 μg/L、44.9 μg/L、49.2 μg/L、49.3 μg/L、49.3 μg/L、48.0 μg/L、49.8 μg/L，平均值＝48.4 μg/L。根据JJF 1059.1-2012规定^[15]，单次测定的标准偏差为

(10)

平均值的标准偏差为

(11)

将上述测定数据代入公式（10）和（11）中，计算得出＝2.2084 μg/L，＝0.7808 μg/L。

那么8次重复测量的相对标准不确定度为

U_4rel0.01614 (12)

2.2.5 线性回归方程拟合引入的相对标准不确定度U_5rel

将1.2.2所述中5个不同浓度的标准曲线工作溶液各进样1次，各标准曲线工作溶液浓度C_S分别为20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、320 μg/L，对应的响应峰面积Y依次为4271、9001、18405、39123、81022。

以标准曲线工作溶液浓度C_S为自变量，响应峰面积Y为因变量，由自变量对因变量作曲线，通过线性最小平方法拟合得到曲线斜率a＝256.6983，截距b＝-1466.2762，相关系数r＝0.9998，回归方程为Y＝a×C_S＋b。

各测定数据及相关回归计算值见表2。

根据线性回归方程拟合所引入的标准不确定度公式^[16]，则标准不确定度为

(13)

残差的标准偏差为

(14)

公式（13）和（14）中，n为标准曲线工作溶液的测定次数，5次；N为样品的进样次数，8次；为白酒样品中纽甜含量测定平均值，48.4 μg/L。将n、N、及表2中数据值代入公式（13）和（14）中，计算得出U₅＝1.5967，S_R＝631.7。

故由线性回归方程拟合所引入的相对标准不确定度为

U_5rel0.03299 (15)

2.2.6 回收率的相对标准不确定度U_6rel

样品通过水相滤膜过滤时，滤膜可能会吸附待测物，进而造成测量值偏小。另外，样品中的基质干扰、仪器的稳定性也会导致测量值偏大或偏小，从而影响测量正确度。测量值的准确性和可靠性，不仅要考虑测定的精密度，也要考虑测定的正确度，而正确度可以通过样品添加标准物质计算回收率来进行评价及校正。

取白酒样品6份，每份按照50 μg/L浓度加标进行回收实验。平行条件下测定6次（n＝6），回收率（Rec）分别是92.34%、95.15%、91.77%、93.63%、93.02%、94.28%，回收率平均值（）为93.37%。根据标准偏差公式，回收率的标准偏差为

(16)

回收率平均值的标准偏差为

(17)

回收率的相对标准不确定度为

U_6rel0.00546 (18)

根据化学分析中不确定度的评估指南建议，通过执行显著性检测与1.0是否有显著性差异来确定回收率是否需要参与结果的校正。

检测统计数据t＝＝13.006。t与95%置信度，自由度5的双边临界值t_(0.95,5)比较，t＝13.006＞t_(0.95,5)＝2.57，说明与1.0有显著性差异，因此应用于结果的校正。

2.3 相对标准不确定度的合成

将各相对标准不确定度分量U_1rel、U_2rel、U_3rel、U_4rel、U_5rel、U_6rel合成，即可得到合成相对标准不确定度U_rel为

＝0.04171 (19)

各相对标准不确定度分量贡献值如图1所示。

2.4 扩展不确定度U(X)及测量结果报告

白酒样品中纽甜含量测量平均值为48.4 μg/L，使用回收率进行校正，校正后的纽甜含量平均值为

51.8 μg/L (20)

依据JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》，对于大多数测量采用置信概率p＝95%，取包含因子k＝2，则扩展不确定度为

4.3 μg/L (21)

故使用超高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中纽甜含量的测量结果表示为X＝(51.8±4.3) μg/L，k＝2。

3 结论

本文系统分析了超高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中纽甜含量的不确定度，通过计算合成了相对标准不确定度及扩展不确定度。鉴于白酒样品中纽甜浓度可能不在本文所使用的标准曲线工作溶液浓度范围内，若超过该浓度范围使用，可能会产生线性偏离，建议另构建标准曲线工作溶液并评估线性相关性是否合理，或将白酒样品稀释至该标准曲线工作溶液浓度范围内，然后再重新评估线性回归方程引入的不确定度，以及考虑白酒样品稀释引入的不确定度。

从各相对标准不确定度分量的数值大小来看，线性回归方程拟合引入的值最大，其次是标准曲线工作溶液定容与稀释和样品重复测量引入的值，第三是回收率和标准物质纯度引入的值，标准物质称量引入的值很小，可忽略不计。

对于线性回归方程拟合引入的相对标准不确定度，其大小与相关系数r有关，r值越接近1，标准曲线的线性相关性越好，则测定结果的不确定度越小^[17-18]。要提高线性相关性，可以从以下几个方面改进：一是保证仪器稳定性，及时对仪器进行校准；二是提高分析人员移液、稀释操作水平和规范性；三是操作时尽量为同一人和使用同一系列玻璃量具；四是增加标准曲线工作溶液点数及测量次数。

对于标准曲线工作溶液定容与稀释引入的相对标准不确定度，需尽量保证实验室温度恒定，且使用准确度更高的量具。对于测量重复性引入的相对标准不确定度，需尽量保证实验环境恒定及仪器进样、检测稳定性，增加样品平行测量次数。因此，在日常工作中应定期做好仪器设备的计量检定、期间核查，严格控制实验环境、条件，规范实验操作，从而提高测定结果的准确性及可靠度。

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第一作者：陈闯（1984—），男，汉族，四川成都人，本科，助理工程师，主要从事食品安全检测，E-mail: chenchuang_fs@163.com

1. 成都海关技术中心 成都 610041

2. 食品安全检测四川省重点实验室 成都 610041

1. Chengdu Customs Technology Center, Chengdu 610041

2. Food Safety Detection Key Laboratory of Sichuan, Chengdu 610041