梅明珠 陈茹 刘志玲 吴晓薇 段燕喻 林志雄 陈俊全 牛晓艺

Abstract Based on the coding gene sequence of African horse sickness virus (AHSV) structural protein VP7 in GenBank, primers and probes were designed for the conserved sequence of VP7 among different serotypes, and the RT-RAA assay of AHSV nucleic acid was established. The primer and probe concentrations were optimized to determine the best responses. The specificity, sensitivity and repeatability of this method were then investigated. The results showed that the RT-RAA detection method for AHSV established in this study could effectively detect the target gene fragment at a constant temperature of 42℃ for 20 minutes, and had no cross reaction with the nucleic acids of other equine animal epidemics and important economic animal epidemics. The detection sensitivity of AHSV positive plasmid reached 10² copies/µL, with good repeatability. The established RT-RAA detection method for AHSV was used to detect 88 serum samples,10 unclotted whole blood samples and 4 mock positive samples collected in the laboratory, and the detection results were consistent with the fluorescent RT-PCR detection results recommended by OIE. Therefore, the established RT-RAA for AHSV, which had a high level of specificity, repeatability and sensitivity, can be employed to the rapid detection of AHSV.

Keywords African horse sickness; reverse transcription recombinase-aided amplification assay(RT-RAA) ; Nucleic acid detection

非洲马瘟 ( African horse sickness，AHS）是由非洲马瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）引起的一种以呼吸系统和循环系统变化为特征的马属动物的急性和亚急性虫媒传染病，常使马、骡致死，其中马的病死率可高达95%，该病的发生能够造成巨大的经济影响^[1]。非洲马瘟被世界动物卫生组织（Office International des Epizooties，OIE）列为法定必须报告的动物疫病，被我国列为进境动物检疫一类传染病。非洲马瘟主要发生在非洲，在我国境内尚未发现。2020年3月17日，非洲马瘟首次出现在泰国，威胁整个东南亚马产业安全。Ayalew Assefa等^[2]根据生态位模型预测，结果显示与我国毗邻的印度被确定为适合该病病毒感染地区。我国Gao Shan等^[3]利用最大熵算法通过我国气候等条件进行预测，结果显示我国南部部分地区是非洲马瘟病毒感染的高风险地区。因此非洲马瘟传入我国的风险越来越大，应立即加强对边境地区的控制。目前没有针对非洲马瘟的有效治疗方法，应用各种诊断技术对该病进行准确和及时的诊断是预防和控制该病的前提^[4]。

非洲马瘟的临床症状和病理变化虽然较为典型，但是仍可与其他引起马属动物发热的疫病混淆，因此需要通过实验室诊断确诊^[5]。基于病原核酸分析的PCR技术因特异性好、敏感性高、操作简单、检测快速，一直在动物疫病病原核酸的检测中发挥着举足轻重的作用^[6-8]。非洲马瘟病原核酸的荧光定量RT-PCR方法也是OIE推荐的替代检测方法之一。重组酶介导核酸扩增（Recombinase-Aided Amplication，RAA）技术是一种新型的病原核酸检测技术，不仅具有荧光定量PCR技术的高灵敏度、高特异性和高准确性，而且无需传统PCR的变性、退火和延伸3个步骤，在温度37～42℃之间即可进行。因此重组酶介导核酸扩增技术在无需昂贵的温控设备的同时，操作简单，在5～15 min就可以得到检测结果，能够实现真正意义上的快检^[9]。目前，RAA技术在细菌、病毒检测以及癌症研究等领域已有应用^[10]。

本研究针对非洲马瘟病毒的结构蛋白VP7的编码基因的保守序列设计引物和探针，建立了逆转录-重组酶介导核酸扩增（Reverse Transcription Recombinase-Aided Amplication，RT-RAA）一步法检测非洲马瘟病毒核酸的方法，为非洲马瘟的快速检测提供一种快速简单的方法。

1 材料和方法

1.1 样本

携带非洲马瘟病毒的结构蛋白VP7编码基因的全长基因的质粒（AHSV-VP7，克隆载体及位点pGH，Amp抗性），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）核酸、马疱疹病毒1型（Equid Herpesvirus-1，EHV-1）核酸、马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）核酸、乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）核酸、马腺疫链球菌（Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus，SEZ）核酸、马流感病毒H3N8（Equine influenza virus，EIV）核酸、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）核酸、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）核酸、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）核酸和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）核酸均由本实验室保存。

临床收集的88份马血清样本和10份马全血样本为本实验室保存。4份非洲马瘟病毒模拟阳性样本为将2 µL浓度为10⁶ copies/µL和10⁴ copies/µL的质粒AHSV-VP7分别添加至100 µL马全血样本，每种浓度设置2个重复。

1.2 探针和引物设计

目前已知非洲马瘟病毒共有9种血清型，不同血清型病毒的毒力强弱不相同。非洲马瘟病毒基因组共有10个片段，编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白，其中结构蛋白VP7在AHSV各血清型中高度保守，是该病毒的血清群特异性抗原^[11]。本研究从GenBank数据库中收集非洲马瘟病毒不同血清型的VP7全基因序列，然后利用MegAlign软件进行比对分析，选择不同血清型间VP7基因的保守序列作为靶序列，按照符合RAA技术要求的原则和探针的修饰方法优选原则，利用引物设计软件Oligo 7.0进行引物和探针的设计，然后对不同的引物对进行筛选，最终确定上下游引物和探针序列，见表1。

表1 非洲马瘟病毒RT-RAA的特异性引物和探针

Table 1 Primers and probes used in the RT-RAA for AHSV

注: 修饰方法 FAM: 6-羧基荧光素; THF: 四氢呋喃; BHQ: 黑洞淬灭剂; Spacer-C3: 3'间臂

1.3 核酸提取

88份马血清样本利用Promega病毒核酸提取试剂盒（货号：AS1150）进行病毒核酸提取。按照操作说明，取200 µL样本原液进行病毒核酸提取，加入70 µL样本洗脱液进行洗脱，提取的核酸立即进行后继试验或者分装置于-20℃保存备用，避免反复冻融。

10份马全血样本和4份非洲马瘟病毒模拟阳性样本病毒核酸提取。首先取100 µL的血液样本加入等量的细胞裂解液和50 µL的蛋白酶K，然后72℃孵育10 min。孵育后将全部液体加入Promega病毒核酸提取试剂盒的提取试剂条的加样孔中进行核酸提取，最后加入70 µL样本洗脱液进行洗脱，提取的核酸立即进行后继试验或者分装置于-20℃保存备用，避免反复冻融。

1.4 RT-RAA反应体系的优化与建立

利用安普未来针对病毒RNA一步法检测的RAA恒温快速扩增试剂盒（荧光型）（货号：WLRE8205KIT）进行非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法的建立和条件优化。参照试剂盒推荐的条件进行引物浓度和探针浓度优化。其中，引物浓度设置终浓度为200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L和500 nmol/L 4种引物浓度进行引物浓度的筛选，即将原始浓度为10 µmol/L的上下游引物，于50 µL的扩增体系中分别加入1 µL（终浓度为200 nmol/L）、1.5 µL（终浓度为300 nmol/L）、2 µL（终浓度为400 nmol/L）和2.5 µL（终浓度为500 nmol/L）进行RT-RAA扩增。探针浓度选取终浓度为30 nmol/L、60 nmol/L、120 nmol/L和180 nmol/L 4种探针浓度进行探针浓度的筛选，即原始浓度为10 µmol/L的非洲马瘟病毒探针，于50 µL的扩增体系中分别加入0.15 µL（终浓度为30 nmol/L）、0.3 µL（终浓度为60 nmol/L）、0.6 µL（终浓度为120 nmol/L）和0.9 µL（终浓度为180 nmol/L）进行RT-RAA扩增。

1.5 特异性试验

利用建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法对质粒AHSV-VP7、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马传染性贫血病毒、乙型脑炎病毒、马腺疫链球菌、马流感病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸样本进行检测，以确定本方法的特异性。

1.6 灵敏度试验

将质粒AHSV-VP7进行10倍的倍比稀释，浓度从10⁹ copies/µL稀释至10¹ copies/µL。然后利用建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法对浓度为10⁶～10¹ copies/µL的质粒AHSV-VP7进行检测，同时用无核酶的水作为阴性对照。

1.7 重复性试验

按照建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法程序进行重复性试验，取浓度为10³ copies/µL的质粒AHSV-VP7进行扩增，重复加样3次，检测荧光信号。

1.8 临床样本的检测

利用建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法对收集的88份马血清、10份马全血和4份非洲马瘟病毒模拟阳性样本核酸进行检测。同时利用OIE手册中推荐的荧光RT-PCR方法^[4]对这102份样本核酸进行检测，比较2种检测方法的结果。同时设置AHSV-VP7阳性对照和无核酶水阴性对照。

2 结果及分析

2.1 反应体系的优化与建立

以10³ copies/µL的质粒AHSV-VP7为模板，引物终浓度为200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L和500 nmol/L分别进行非洲马瘟病毒RT-RAA扩增。结果显示，当引物终浓度为300 nmol/L，即10 µmol/L的引物加入量为1.5 µL时，扩增曲线的Ct值最小，扩增效果最好（图1）。因此本研究选取引物终浓度为300 nmol/L作为本方法的最终引物浓度。图1中阴性水对照未标注。

图1 引物浓度试验结果

Fig.1 Amplification results of primers with different concentrations

以10³ copies/µL的质粒AHSV-VP7为模板，探针终浓度为30 nmol/L、60 nmol/L、120 nmol/L和180 nmol/L分别进行非洲马瘟病毒RT-RAA扩增。结果表明：当加入0.3 µL 10 µmol/L的探针，即体系中探针终浓度为60 nmol/L时，扩增曲线的Ct值最小，样本扩增效果最好（图2）。因此本研究选取探针终浓度为60 nmol/L作为本方法的最终探针浓度。图2中阴性水对照未标注。

图2 探针浓度试验结果

Fig.2 Amplification results of probes with different concentrations

根据优化后的引物和探针浓度，确定最终非洲马瘟病毒RT-RAA检测反应体系为：每50 µL反应体系中加入29.4 µL Buffer A，1.5 µL 10 µmol/L的上游引物AHSV-F，1.5 µL 10 µmol/L的下游引物AHSV-R，0.3 µL 10 µmol/L的探针AHSV-P和9.8 µL 无核酶的水，将上述试剂混合后加入到含有反转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、dNTPs和ATP等的RT-RAA反应单元冻干粉中，然后加入5 µL 样本核酸，最后加入2.5 µL的Buffer B。加完后立即瞬时离心，然后振荡混匀，最后置于荧光检测仪中进行反应。设置反应程序为：恒温42℃，每30 s采集一次FAM通道的荧光信号，反应时间20 min。

2.2 特异性试验

利用本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA方法对EAV、EHV-1、EIAV、JEV、SEZ、EIV、AIV、NDV、PCV2、PRRSV核酸和质粒AHSV-VP7进行检测。结果显示：仅质粒AHSV-VP7出现正常扩增曲线，阴性对照及EAV、EHV-1、EIAV、JEV、SEZ、EIV、AIV、NDV、PCV2、PRRSV核酸均未出现扩增曲线（图3），说明本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法能特异性扩增出AHSV中的靶序列，而与其他马属动物疫病病原及重要经济动物疫病病原核酸无交叉反应。图3中阴性水对照和除质粒AHSV-VP7外的动物疫病样本未标注。

图3 非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法特异性试验结果

Fig.3 Specificity of the RT-RAA for AHSV

2.3 灵敏度试验

取10⁶～10¹ copies/µL的质粒AHSV-VP7作为模板，按照优化后的条件进行非洲马瘟病毒RT-RAA扩增，同时用无核酶的水作为阴性对照。结果显示：利用本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA方法检测系列稀释的质粒AHSV-VP7，最快在5 min内就有明显扩增。质粒浓度为10⁶～10² copies/µL时，10 min内均有扩增，说明该方法的检测灵敏度可达到10² copies/µL（图4）。

图4 非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法灵敏度试验结果

Fig.4 Sensitivity of the RT-RAA for AHSV

2.4 重复性试验

利用本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA方法对中低浓度的质粒AHSV-VP7（10³ copies/µL）进行扩增，结果显示当质粒浓度为10³ copies/µL时，本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA方法都有良好的扩增曲线，扩增结果一致（图5）。

图5 非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法重复性试验结果

Fig.5 Repeatability of the RT-RAA for AHSV

2.5 临床样本的检测

利用建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法对收集的88份马血清、10份马全血和4份非洲马瘟病毒模拟阳性样本核酸进行检测，同时设置质粒AHSV-VP7阳性对照和阴性水对照。检测结果显示88份血清和10份马全血样本利用非洲马瘟病毒RT-RAA和OIE推荐的荧光RT-PCR方法检测，结果全为阴性（图6），4份非洲马瘟病毒模拟阳性样本利用非洲马瘟病毒RT-RAA和OIE推荐的荧光RT-PCR方法检测，结果全为阳性（图7）。两种方法检测结果一致。

3 讨论与结论

2010年广州从化无规定马属动物疫病区获批建成，保障了第16届亚运会马术项目的成功举办，并在赛后实现马常态化往返粤港两地。2022年杭州桐庐无规定马属动物疫病区又获批建成，为2023年杭州亚运马术比赛和2025年全运会马术比赛提供保障。为了更好地保证我国的马产业持续稳定发展，马属动物疫病监测不可松懈。非洲马瘟是17种跨界动物疫病之一，具有高度传染性，可在全球范围内迅速传播，造成重大的社会经济和公共卫生后果^[1]，因此在马属动物疫病监测中尤为重要。

动物疫病的病原核酸检测是疫病早期识别、口岸检疫、及时报告和快速处置的关键，不论是近年的非洲猪瘟流行还是新冠肺炎的暴发，都让我们认识到了病原核酸检测在疫病防控中的重要作用。目前针对非洲马瘟病毒核酸检测的方法主要有OIE推荐的基于琼脂糖凝胶电泳的普通RT-PCR^[12]和实时荧光定量RT-PCR^[13-14]。基于琼脂糖凝胶电泳的普通RT-PCR，在RT-PCR扩增完毕后还需开盖进行琼脂糖凝胶电泳，操作繁琐，且在一定程度上容易造成气溶胶的污染。此外，相对于荧光定量RT-PCR，普通RT-PCR的检测灵敏度相对较弱，须达到10³ copies/µL才能检出。非洲马瘟病毒荧光RT-PCR可以直接进行结果判定，无需后继的开盖试验，因此有效避免了普通RT-PCR气溶胶污染问题。但是其需要经过变性、退火和延伸3个步骤，一次样本检测需要2 h左右。本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法，后继无需开盖试验，可以直接进行结果判定，有效避免气溶胶污染问题的同时，无需传统PCR的变性、退火和延伸3个步骤，一次样本检测扩增仅需20 min。当样本浓度为10⁶ ～10² copies/µL时，10 min内就可见明显的扩增，检测灵敏度能够达到10² copies/µL，能够媲美荧光RT-PCR^[7]。利用本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA方法对收集的88份马血清、10份马全血和4份非洲马瘟病毒模拟阳性样本进行检测，结果与OIE推荐的荧光RT-PCR结果一致，说明本研究建立的RT-RAA方法准确性高，能够作为非洲马瘟病毒核酸检测方法的备选方法之一。

综上所述，本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA方法特异性强、敏感性高、重复性好，能够精准识别目标基因片段；操作简便，无需变温，在5～15 min就可以得到荧光检测结果；对设备要求低，不需要昂贵的温控设备，突破了传统PCR和荧光定量PCR技术在技术、仪器和空间上的限制，更适合资源有限的基层和口岸现场动物疫病检测及推广应用。

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