李春雷 王溪桥 张宇霞 文朝慧 尤 佳 刘志业

甘肃省是全国最大的蔬菜、花卉外繁制种基地，随着各类农作物制种面积逐年增加，境外繁育种子基地的入区原材料种类繁多，其携带入境的有害生物种类越来越多，风险也随之增大。其中，检疫性病虫害大幅增加，将会严重影响种子质量和产量，因此监测外来病虫害就显得尤为重要。目前病虫害的检疫鉴定工作以传统形态鉴定为主，而形态鉴定方法主要针对成虫，对成虫虫体的完整性要求较高^[1]，且花费时间较长，需要鉴定人员具备丰富的物种分类鉴定经验。而在兰州口岸有害生物监测工作中，捕获的有害生物通常是幼虫或残体，用传统形态鉴定方法来监测可能会极大地降低口岸检疫的速度，影响通关时效。

生物种类的鉴定多采用分子生物学方法。由于DNA的检测及分析具有准确、简便、快速等特点，因此被广泛应用于鸟类、蛾类、甲虫、蝇、弹尾虫等物种鉴定的研究中^[2-10]。DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种、标准、有足够变异、易扩增且相对较短的DNA片段^[11]。其以线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidase subunit I，COⅠ）基因中的一段序列片段作为目标，设计特异性引物来鉴定物种。大量研究结果表明，COⅠ是最适合用来研究动物物种鉴定的DNA条形码基因^[12]，同时随着Genbank数据库中COⅠ序列的不断增加，使DNA条形码鉴定技术的优势愈发凸显。与传统鉴定方法相比，有以下几点优势：简便易操作，非专业人员在短时间内能够掌握并准确鉴定，不需要太多分类知识；准确度高，对于近似种等肉眼较难区分的种类，能够从分子水平更好地区分；检测样本范围扩大，即使样本部分受损也不会影响识别结果^[13]。综上，DNA条形码技术在鉴定外来入侵物种方面应用前景广阔。本研究利用DNA条形码技术对兰州新区铁路口岸监测的虫害进行鉴定，以期为DNA条形码在有害生物快速鉴定中的应用提供重要的理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 供试样品

供试样品标本为金城海关采集，采集地点为兰州新区铁路口岸，标本浸入100%无水乙醇中-20℃条件下保存，待用。

1.2 检测试剂与仪器

核酸提取试剂盒Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit、PCR反应试剂盒Premix Taq（R004A）、DL 1000 DNA marker、引物合成服务均购自宝生物（TaKaRa）公司。

PCR仪：Eppendorf Mastercycler nexus；微量核酸蛋白检测仪：Eppendorf Bio Spectrometer。

1.3 方法

1.3.1 形态学鉴定方法

依据《中国进境植物检疫性蛾类图鉴》《北京灯下蛾类图谱》《储藏物甲虫彩色图鉴》《普通昆虫学》《植物病虫害识别图鉴》《甘肃农作物病虫害》等，利用Leica 205A立体显微镜对采集的标本进行观察并鉴定。

1.3.2 DNA条形码鉴定方法

（1）核酸提取

剪取标本25 mg肢体，参照试剂盒说明书进行提取，以dd H₂O为空白对照，提取完成后测定浓度。

（2）PCR扩增

参考Folmer所使用的PCR扩增引物^[5]，使用通用引物进行DNA扩增，引物序列LCO1490，5'-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3'；HCO2198，5'-TAAACTTCAGGGTGAC CAAAAAATCA-3'。反应扩增体系为25.0 μL，其中Premix Taq12.5 μL、20 μmol/L上、下游引物各1.0 μL、模板DNA 2.0 μL、dd H₂O 8.5 μL。反应程序：94℃预变性3 min；94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。COⅠ基因PCR扩增粗产物大小应为685 bp。产物4 ℃保存，1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

（3）PCR产物测序及基因序列比对分析

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测确证后，送西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序，测序获得的DNA序列在NCBI（网址 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）及BOLDsystem（网址 http://www.boldsystems.org）在线数据库进行比对分析，以确保获得的序列为目的基因片段。

2 鉴定结果

2020年和2021年在兰州新区铁路口岸共采集标本289头，未发现检疫性有害实蝇。其中2020年和2021年分别采集鉴定145头和144头虫害。2020年以形态鉴定法为主，在所鉴定的145头虫害中有44头虫害未鉴定到种，依据形态鉴定法只鉴定到科，占比30.3%。2021年结合形态鉴定法和DNA条形码方法，鉴定的144头虫害中，仅有16头是应用形态鉴定方法完成，占11.11%，而利用DNA条形码方法鉴定的虫害占比高达88.89%；144头虫害鉴定到种的比例高达96.6%。

2.1 形态鉴定结果

2020年共鉴定了145头虫害，均采自兰州新区铁路口岸。经鉴定，监测的虫害主要集中在天蛾科（Sphingidae）、舟蛾科（Notodontidae）、螟蛾科（Pyralidae）、卷蛾科（Tortricidae）、木蠹蛾科（Cossidae）、菜蛾科（Plutellidae）、步甲科（Carabidae）、花金龟科（Cetoniidae）、夜蛾科（Noctuidae）等9个科。2021年共鉴定了16头虫害，经鉴定，监测的虫害主要集中在夜蛾科（Noctuidae）、木蠹蛾科（Cossidae）、天蛾科（Sphingidae）、大蚊科（Tipulidae）、草螟科（Crambidae）、金龟子科（Scarabaeidea）、鳃金龟科（Melolonthidae）等7个科。具体参见表1。

2.2 DNA条形码鉴定结果

利用DNA条形码结合形态鉴定法共鉴定出有害生物128头，均为2021年采自兰州新区铁路口岸，分属于尺蛾科（Geometridae）、夜蛾科（Noctuidae）、灯蛾科（Arctiidae）、天蛾科（Sphingidae）、鳃金龟科（Melolonthidae）、金龟子科（Scarabaeidea）、犀金龟科（Dynastidae）、卷蛾科（Tortricidae）、花蝇科（Anthomyiidae）、寄蝇科（Tachinidae）、胡蜂科（Vespidae）、蜜蜂科（Apidae）、隧蜂科（Halictidae）、蝇科（Muscidae）、大蚊科（Tipulidae）、摇蚊科（Chironomidae）等16个科。详见表2。

2.2.1 PCR扩增结果

分别以128份标本样品DNA为模板，以DNA条形码通用型引物LCO1490/HCO2198进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示128份DNA均扩增出与目的片段长度相符的基因片段，大小为685 bp（图1），说明引物通用性较高。

图1所示仅为128份标本中的部分样品，其中条带较亮的（如1～8、13、16号样品）可直接用于测序，而针对条带较弱的（如10～12、14～15号样品），采取以PCR产物为模板进行第二次扩增的方法来增加产物浓度，保证后续的测序工作。


M: DL 1000 DNA Marker; 1～8, 10～16: 虫害样品; 9: 阴性对照

图1 编号为1～15号样品COⅠ基因扩增结果

Fig.1 Results of the COⅠ gene amplification in samples 1-15

2.3 序列分析与同源性比对

对电泳检测验证合格的PCR产物进行纯化和序列测定，获得了128条COⅠ基因序列，由于测序过程中会出现错配的情况，在序列比对前去除错配的碱基，然后将调整好的序列在NCBI和BOLDsystem两个数据库中比对。经过比对，每条序列与相对应种的相似度均在99%～100%，说明获得的COⅠ序列准确可靠。

3 分析与讨论

从研究材料看，2021年中有高达88.97%的昆虫都存在不完整的问题，以传统形态鉴定方法无法完成虫害的鉴定。应用DNA条形码技术，通过提取残体的DNA，可对采集的标本进行准确的鉴定。采集的144头虫害，只有16头虫害可以通过形态学方法进行鉴定。通过分子生物学方法来进行昆虫鉴定是利用形态学鉴定效率的8倍有余；无法通过形态鉴定的大部分昆虫，通过DNA条形码技术扩增、测序后，也得到相同的结果，表明DNA条形码技术用来鉴定昆虫是科学、可靠的。DNA条形码技术填补了兰州口岸有害生物鉴定的空白，为今后口岸有害生物监测提供新的思路和方法。

从鉴定技术看，DNA 条形码技术可以通过建立数据库，一次性快速鉴定大量样本。利用该特点在今后的有害生物监测中，补充应用 DNA 条形码技术鉴定2020年以形态鉴定方法鉴定的有害生物，进一步验证DNA条形码技术可一次性鉴定大量样本的特性。此外，由于本研究所采集的虫害中不包含幼虫，因此缺少DNA条形码对幼虫的检测鉴定，在今后对有害生物的监测中，将把利用 DNA 条形码技术对幼虫的鉴定作为研究重点，来佐证本研究的结果，同时丰富本研究的内容。

从鉴定结果看，本研究中289个虫害分属于26科，未发现外来入侵物种，说明口岸对外来有害生物的监测工作是有效的。但是由于甘肃省是我国苹果优势产区和生产大省，本研究中发现的梨小食心虫对苹果的产量和质量将会构成很大威胁，所以今后应该对苹果的优势产地、出口苹果地区做进一步的虫害调查，了解当地的虫害分布情况及发生情况，应用DNA条形码技术快速准确地鉴定当地虫害，以便采取有效的防控防治措施，同时扩展本研究的深度和广度。

DNA条形码虽然具有很多突出的优点，得到了很多领域学者的支持，然而随着研究的不断深入，我们发现该技术存在一些不足，还未完善到普及的程度，在一些类群中通用性较低。本研究中也有少数几个虫害未检定到种，可能是由于数据库中未录入该种的序列信息，因此只鉴定到属或种；或许是该技术还需要其他方法的辅助，以便更准确地进行物种鉴定。今后，以多个基因片段为研究对象的DNA条形码鉴定系统将会成为趋势，未来的DNA条形码研究应结合形态学、生物学以及生态学，从而得出更为科学准确的结果。

4 结论

本研究结果表明，DNA条形码技术可以弥补形态鉴定法的局限性，对有害生物进行准确的鉴定，为口岸有害生物的快速识别与鉴定提供科学依据和实践基础。本研究所捕获的289头虫害，通过形态学鉴定及DNA条形码鉴定技术进行了细致的鉴定。最终将这289头昆虫进行了分类，它们分属于天蛾科、舟蛾科、螟蛾科、卷蛾科、木蠹蛾科、菜蛾科、步甲科、花金龟科、夜蛾科、大蚊科、草螟科、金龟子科、鳃金龟科、尺蛾科、灯蛾科、蠹蛾科、鳃金龟科、金龟子科、犀金龟科、蝇科、花蝇科、寄蝇科、胡蜂科、蜜蜂科、隧蜂科、摇蚊科等26个科。其中，2020年以形态鉴定法为主，在145头标本中有44头虫害因标本的完整程度受损而未鉴定到种，占比30.3%；2021年在形态鉴定法的基础上，结合了DNA条形码技术，在144头标本中只有5头未鉴定到种，占比3.4%，这表明DNA条形码技术可以对虫害进行准确鉴定，且不受标本完整程度的影响。

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