周有良 胡春凌 潘丽 陈夫志 孙玉莲 葛斌鹏

蚊媒病毒引起的蚊媒传染病可对人类和社会造成严重危害^[1-2]。引起蚊媒传染病的主要病毒有流行性乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）、登革热病毒（Dengue Fever Virus，DENFV ）、基孔肯雅热病毒（Chikungunya Virus，CHIKV）、寨卡病毒（Zika Virus，ZIKV）等，这些病毒引发的疾病均对人类健康造成极大威胁，严重影响正常的社会秩序和民众的日常生活^[3-5]。通过对蚊媒病毒进行快速、准确地检测，可以有效预防和控制蚊媒传染病。

1 材料与方法

1.1 标本

甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等标本来自江苏国际旅行卫生保健中心苏州分中心门诊部；流感病毒（Flu Virus）、乙型脑炎病毒（JEV）、基孔肯雅热病毒（CHIKV）、登革热病毒（DENV）等标本来自苏州市第五人民医院门诊发热病人，均采静脉血2 mL，分离血清，-70℃保存。

1.2 主要试剂及仪器

含JEV、DENV、CHIKV、ZIKV、YFV和RVFV扩增基因的标准品质粒（Takara），荧光编码微球（Luminex，1.25×10⁷个/mL），链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE, 1 mg/mL，Invitrogen），Shead Fluid（Luminex），MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0（Takara），PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix（Takara），SuperPlex™ Premix（Clontech），液相芯片检测系统（MAGPIX型，Luminex），PCR仪（TC9600-G，Labnet）。

1.3 方法

1.3.1 方法的建立及原理

通过生物信息学分析软件对流行性乙型脑炎病毒（JEV）、登革热病毒（DENV）、基孔肯雅热病毒（CHIKV）、寨卡病毒（ZIKV）、黄热病病毒（YFV）、裂谷热病毒（RVFV）基因组序列进行序列比对分析，设计特异的多重PCR扩增引物和特异性捕获探针，建立多重PCR扩增体系。基于液相芯片高通量多重快速检测和灵活组合的技术优势，结合多重PCR扩增技术建立乙脑病毒（JEV）等6种蚊媒病毒同时检测的方法。如果PCR产物和探针完全配对，则微球上相应探针捕获到标有Biotin的PCR产物，加入SA-PE后，形成微球-捕获探针-Biotin标记PCR产物-SA-PE复合物，在液相芯片检测仪上即可检测到对应微球的荧光信号，根据信号强弱判定检测结果^[6]。

1.3.2 方法的特异性评价

通过提取病毒标本的DNA或RNA，将RNA反转录成cDNA，用所获得的DNA和cDNA样品为检测模板，采用1.3.1所述方法对乙脑病毒（JEV）等6种蚊媒病毒进行检测，评价该方法的特异性。

1.3.3 方法的临床标本检测应用研究

对50例发热病人血清标本提取RNA，反转录成cDNA。采用液相芯片法和商业化荧光PCR检测试剂盒分别对核酸样本进行检测。液相芯片法采用1.3.1所述方法一次性同时对乙脑病毒（JEV）等6种蚊媒病毒进行检测的新型检测方法。采用商业化荧光PCR检测试剂盒，包括乙型脑炎病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、登革热病毒通用型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、基孔肯雅热核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）、寨卡病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、黄热病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法）、裂谷热病毒（RVFV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）分别进行检测，并比较液相芯片法和荧光PCR法的检测结果。

2 结果

2.1 特异性评价

检测结果以荧光信号值（MFI）表示。实验结果显示，对于乙型脑炎病毒（JEV）、基孔肯雅热病毒（CHIKV）、登革热病毒（DENV）及蚊媒病毒标准品质粒样品，检测结果为阳性。对于甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、流感病毒（Flu Virus）样品，检测结果为阴性。结果表明，所建立的液相芯片技术检测蚊媒病毒方法的特异性较好，没有出现不同病毒之间检测结果相互干扰的现象，见表1。

2.2 临床标本检测应用

液相芯片法和荧光PCR法的检测结果见表2和表3。50例发热病人血清标本，液相芯片法和荧光PCR法分别检出阳性11例，其中，流行性乙型脑炎病毒（JEV）阳性3份、登革热病毒（DENV）阳性6份、基孔肯雅热病毒（CHIKV）阳性2份，两种检测方法得到的检测结果一致。实验结果表明，所建立的液相芯片技术检测蚊媒病毒方法为高通量检测方法，能一次对6种蚊媒病毒同时检测，相对于每次只检测一个指标的荧光PCR检测试剂盒，操作简便、快速，提高了检测效率，可用于口岸出入境对蚊媒病毒感染的筛查检测。

3 讨论

蚊媒传染病具有传播力强、流行面广、种类繁多、发病急、危害重等特点，给人类健康带来较大威胁，是重要的公共卫生安全隐患。经济全球化的加速极大地促进了国际贸易和旅游业的快速发展，随着国际间人员流动、交通往来和货物贸易日益频繁，极大地增加了蚊媒疾病在国际间传播扩散的可能性，使得原本局限于一个地域或国家内的疾病突破地域界限，引起世界范围内的广泛传播与流行。同时，随着全球环境的变化，特别是全球温度升高等因素为蚊媒疾病的传播提供了更便利的自然条件^[7]。虽然有些蚊媒传染病暂未在我国发现原发病例或引起流行，但是随着经济全球化及自然环境的变化，蚊媒病毒传播和扩散的风险逐渐增加，我国也随之有被蚊媒病毒侵入、疫情暴发及流行的风险。值得关注的是，由于蚊媒病毒具有传播媒介相同，病毒种类多，所引发的临床症状为相似的发热、皮疹、关节痛等，给疾病的快速诊断造成了较大的困难^[8-9]，因此，建立能准确、快速检测各种蚊媒病毒的筛查检测方法是预防和控制蚊媒传染病的关键措施之一，对蚊媒病毒进行快速、准确检测具有非常重要的意义。蚊媒病毒的常见检测方法包括动物或细胞接种分离鉴定，基于ELISA检测IgG及IgM抗体的血清学检测方法，分子生物学方法如PCR、qPCR等^[8,10-13]。在这些常见检测方法的基础上，研究开发新型检测方法具有非常重要的意义，也是检测需求的发展趋势。

通过基因标准品质粒模拟临床标本对6种病毒的任意组合，采用液相芯片法已得到验证^[6] ，本文进一步评价了该方法的特异性，在同时检测甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、流感病毒（Flu Virus）、乙型脑炎病毒（JEV）、基孔肯雅热病毒（ZIKV）、登革热病毒（DENV）核酸样本时，没有出现不同病毒之间检测结果相互干扰的现象，具有良好的特异性。与荧光PCR法进行比较，两种方法检测结果一致。本研究临床样品数量有限，寨卡病毒病、黄热病和裂谷热未收集到阳性标本，两者之间的比较有待进一步探讨。液相芯片法和荧光PCR法对蚊媒病毒的检测均有重要意义，在实际检测中，根据实验条件采用多种方法进行检测，可大大提高对蚊媒病毒感染诊断的准确度。

4 结语

综上所述，本文对检测蚊媒病毒方法的讨论研究是基于液相芯片技术所建立的高通量检测方法^[6]，能一次性对多种蚊媒病毒同时检测，实现一次检测筛查多种病毒。相对于每次只检测一个指标的荧光PCR检测试剂盒，操作简便、快速，提高了检测效率，适用于口岸出入境发热旅行者蚊媒病毒感染的筛查检测。

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