蒲静 高志强 汪琳 种炎 赖平安 张利峰 白子龙 杜思乐

Abstract Based on the multiple alignment of the mitochondrial gene sequences of Asian elephant (Elephas maximus), African elephant (Loxodonta africana and Loxodonta cyclotis) and Woolly mammoth (Mammuthus primigenius) published in GenBank, a pair of universal primers and three species-specific probes were designed. By optimizing the primer probe concentration, reaction system and conditions, a triplex real-time PCR was developed to detect the ivory and its products seized at ports. The established PCR was not only specific and sensitive, but also can effectively identify the existing Asian ivory, African ivory and mammoth ivory. By micro-destructive sampling, a total of 5 ivory intercepted at the port were subjected, and the test results were consistent with of the current standard conventional PCR method. This study showed that the established triplex real-time PCR for Asian elephant, African elephant and mammoth was suitable for the accurate and rapid detection of ivory and its products, and provided a new and reliable means for the identification of ivory and its products intercepted at the port.

Keywords intercepted at ports; ivory and its products; multiplex real-time PCR; accurate identification

现生象牙属于濒危野生动物制品，禁止贸易、携带、邮寄进出境。近年来，为保护大象种群健康发展，推进生物多样化保护行动，各地海关严格执法、严厉打击走私象牙等野生动物产品的违法行为。目前现生象仅剩两属三种：亚洲象（Elephas maximus）、非洲草原象（Loxodonta africana）和非洲森林象（Loxodonta cyclotis）。象科物种还包括猛犸象（Mammuthus primigenius），猛犸象生活在距今1万多年前的时代，其化石通常保存良好，可作为现生象牙制品的高质量替代物^[1-2]。由于猛犸象未被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES），因此猛犸象象牙的商业贸易不受限制，部分走私者故意在现生象牙上粘贴灭绝猛犸象的标签以逃避海关查验监管。海关在对进出境物品的监管中经常截获到象牙及其制品，由于加工工艺及多种伪造手段，经常难以通过形态学鉴定法准确识别现生象牙和猛犸象牙制品，不利于海关执法。因而，对口岸截获的象牙及其制品进行象源性物种的精准鉴定变得越来越重要。

象的线粒体COⅠ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ）和细胞色素b（cytochrome b，Cytb）基因是该物种最具鉴定意义的靶基因^[3]。我国现行行业标准《象牙及其制品鉴定技术规范》（SN/T 5275-2019）中规定的分子生物学检测方法以及诸多文献中用于象牙鉴定的线粒体靶基因均位于上述基因范围内。但由于象科物种之间基因序列同源性较高，目前使用的方法多为普通PCR结合测序，以实现现生象和猛犸象的鉴定，但该方法检测周期长，不利于口岸的快速通关和精准执法。鉴于此，本研究建立了能够同时检测亚洲象、非洲象和猛犸象的三重实时荧光PCR快速鉴别检测方法，为口岸截获的象牙及其制品提供快速、敏感、精准的分子鉴定方法。

1 材料和方法

1.1 亚洲象、非洲象、猛犸象等物种线粒体基因质粒的合成

参照GenBank中亚洲象、非洲象（包括非洲草原象、非洲森林象）和猛犸象的参考序列，分别合成上述象Cytb基因全长并克隆入pUC57载体，得到4种象线粒体基因质粒，作为亚洲象、非洲象和猛犸象的阳性质控品。参照GenBank中抹香鲸、独角鲸和海象的参考序列，分别合成Cytb基因全长并克隆入pUC57载体，得到3种线粒体基因合成质粒作为象源性鉴定方法的特异性验证样品。上述7种质粒均由上海生工合成。GenBank参考序列号、Cytb合成长度和合成质粒名称等信息见表1。

1.2 主要试剂

TIANamp微量样品基因组DNA提取试剂盒（DP316）购自天根生化科技有限公司；Ex HS Taq DNA聚合酶、10×Ex Taq PCR Buffer、dNTP、MgCl₂等均购自TaKaRa公司。

1.3 引物探针设计合成

下载亚洲象、非洲象（非洲草原象和非洲森林象）、猛犸象的基因序列，对线粒体基因Cytb进行多重序列比对（图1），其中，非洲草原象和非洲森林象的Cytb序列同源性较高，无法通过Cytb基因区分开，但能与亚洲象和猛犸象区分，因而针对象科物种Cytb基因保留兼具种属特异性的序列区域，设计1对象通用引物以及3条针对亚洲象、非洲象和猛犸象的特异性MGB探针。引物探针均由上海生工合成，引物探针的名称、序列及靶基因见表2。

1.4 三重实时荧光PCR方法的建立和优化

使用ABI QuantStudio 5荧光PCR仪对引物、探针、Mg²⁺等各组分浓度进行优化，并对最优反应参数进行筛选和验证。

1.5 三重实时荧光PCR方法的灵敏度

将经测定计算的已知拷贝数的3种象合成质粒A-Cytb-pUC57、FC-Cytb-pUC57和M-Cytb-pUC57分别做10倍系列稀释，应用优化的反应体系进行检测，确定建立方法的分析灵敏度。

1.6 标准曲线的建立

对质量浓度为6×10³～6×10⁸ copies/mL的3种象质粒DNA进行检测，并选取其中5个梯度，以Ct值平均值为纵轴，质粒浓度为横轴，进行线性回归分析并作标准曲线，计算回归系数（R²）和PCR扩增效率。

1.7 特异性实验

应用建立的反应体系，对牛骨DNA、抹香鲸线粒体基因合成质粒、独角鲸线粒体基因合成质粒和海象线粒体基因合成质粒等进行检测，以验证方法的特异性。

1.8 对口岸截获象牙制品的检测应用

1.8.1 口岸截获象牙制品的核酸提取

按照《象牙及其制品鉴定技术规范》（SN/T 5275-2019）标准方法中8.2.1“样品处理和DNA提取”进行样品前处理，再使用TIANamp微量样品基因组DNA提取试剂盒（DP316）提取核酸。注意样品之间避免交叉污染。

1.8.2 口岸截获象牙制品的检测鉴定

应用建立的多重实时荧光PCR方法对口岸截获的5份疑似象牙制品进行实际应用检测，并与现行标准方法进行比较^[4]。

2 结果与分析

2.1 三重实时荧光PCR反应条件优化

经优化确立的象三重实时荧光PCR反应体系：每个反应体系均包含1×Ex Taq PCR Buffer、200 nmol/L dNTP、0.4 μmol/L象通用引物对、3种探针各0.2 μmol/L 。反应参数：95℃ 3 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环；每个循环在60℃时收集荧光信号。

2.2 灵敏度实验

建立的三重实时荧光PCR可以稳定检出6 copies/μL的亚洲象质粒、非洲象质粒和猛犸象质粒DNA（图2），多次重复实验显示Ct变异系数小于5%，均一性良好，表明方法的灵敏度可以满足要求。

2.3 标准曲线与荧光PCR效率计算

对已知浓度的亚洲象、非洲象和猛犸象质粒DNA进行检测。检测结果经计算后进行线性回归，获得的相关数据及方程图形如图3所示。结果显示PCR反应效率分别为98.63%、101.59%和100.17%；R²均为1，表明建立的方法扩增效率较高。

图2 三重实时荧光PCR灵敏度实验

Fig.2 The sensitivity test of triplex real-time PCR

图3 三重实时荧光PCR多重标准回归曲线

Fig.3 Multiplex standard regression curves of triplex real-time PCR

2.4 特异性实验

使用建立的三重实时荧光PCR方法对牛骨DNA、抹香鲸线粒体基因合成质粒、独角鲸线粒体基因合成质粒和海象线粒体基因合成质粒等，与合成的亚洲象、非洲象（非洲草原象和非洲森林象）及猛犸象质粒同时进行检测。结果显示建立的检测方法能够检测出全部象科物种，与其他物种DNA无交叉反应，特异性良好，如图4所示。

2.5 口岸截获疑似象牙制品的检测应用

使用建立的三重实时荧光PCR法对口岸截获的5份疑似象牙制品进行检测，并与现行标准方法进行比较。结果显示，5份疑似象牙制品经三重实时荧光PCR检测，2号与3号为非洲象，5号为猛犸象（图5）；使用标准方法进行检测，第一轮PCR扩增后毛细管电泳显示2号、3号和5号均出现特异性条带（图6）；对PCR扩增得到的片段进行测序分析，2号与3号均为非洲草原象，5号为猛犸象。上述检测结果表明建立的三重实时荧光PCR方法与标准方法的检测结果完全一致。

图5 口岸截获疑似象牙制品的实时荧光PCR检测结果

Fig.5 Real-time PCR results for suspected ivory products intercepted at ports

3 讨论

濒危物种保护的前提是能够准确识别和鉴定。分子遗传学建立之前，物种鉴定主要依靠对不同种属物种的形态、剖检知识和显微结构来识别，但濒危物种的非濒危近缘种的存在以及加工后濒危物种制品在形态特征上的损失给准确鉴定带来极大困难^[5]。利用分子遗传标记技术进行物种识别是物种鉴定技术的重大进展和提升。将分子遗传标记检测鉴定技术作为物种鉴定的一种辅助手段，极大提升了濒危物种及其制品的识别和鉴定准确度^[6]。目前用于濒危物种鉴定的分子生物学方法主要包括针对线粒体基因的DNA条码技术、RFLP、位点特异性荧光PCR等，以及针对核基因的微卫星鉴定和SNP位点检测等^[7-8]，其中特异性荧光PCR方法以其快速、特异且精准，对标本质量要求不高等优点，在物种鉴定领域中得到广泛应用^[9-10]。

大象作为一种极度濒危物种，目前仅存两属三种，主要分布于亚洲和非洲。为保护这一濒临灭绝的物种，世界上绝大部分国家都遵守《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES），将现生象牙及其产品贸易认定为违法行为。但象牙的偷猎和走私贸易仍然大量存在，对世界大象种群构成严重威胁。由于口岸截获的疑似象牙制品常常存在外观特征不明显、老化严重等问题，而口岸截获样本的取样检测不能明显破坏其外观，这严重制约了疑似象牙制品的准确鉴定。本研究的目的是设计和建立一种灵敏、准确的位点特异性荧光PCR分析鉴定方法，实现快速、准确地对口岸截获的疑似象牙制品中的大象种特异性DNA进行鉴定。本研究通过比对亚洲象、非洲象和猛犸象的Cytb基因找出特异性识别位点，设计种特异性MGB双标记探针，建立了一套可快速检测鉴定3种象的三重实时荧光PCR方法，并初步评价和验证了方法的有效性。结果显示该方法灵敏、特异，与其他近似象物种的DNA无交叉反应。Wozney K M等^[10]也建立了针对3种象的荧光PCR检测方法，研究显示该方法灵敏度可达100拷贝，在靶标含量低于100拷贝时，方差显著增大。而本研究建立的多重荧光PCR方法，灵敏度为30拷贝，且对于低至30拷贝的目标DNA，多次重复实验结果显示Ct值均一性仍然良好，变异系数小于5%。有研究表明，不同象牙制品提取的DNA模板量范围较大，有些样品提取的DNA量可能低于20 copies/μL^[9]，而且部分样本由于老化严重导致核酸降解，造成DNA模板完整性的缺失，因此对于需要较长扩增片段的检测方法可能出现假阴性结果。本研究建立的方法扩增片段短，仅为103 bp，理论上对于可能发生模板降解的样本也能得到有效扩增，适用性更好。此外，象牙制品的核酸提取也是成功扩增的关键。按照标准方法操作通常能够有效提取核酸，但需充分进行脱钙和蛋白酶K消化处理过程，样品处理和核酸提取过程要按照实验要求佩戴口罩和手套，避免人源性DNA的污染，同样可以使用专门用于微量基因组核酸提取的商品化试剂盒。本研究从口岸截获的5份疑似象牙制品中，检测鉴定出2份非洲象牙制品和1份猛犸象牙制品，同时使用现行标准方法进行验证，结果表明建立方法与标准检测结果一致。今后仍需进一步加大比对样品数量，以期在口岸中获得更为广泛的应用。

4 结论

本研究利用位点特异性荧光PCR技术，通过设计1对象通用引物和3条种特异性探针，建立了可以有效鉴别亚洲象牙、非洲象牙以及猛犸象牙及其制品的三重实时荧光PCR检测方法。灵敏度实验显示该方法可稳定检出6 copies/μL的目标DNA，特异性实验显示不与其他近似象物种DNA发生交叉反应。将建立的象牙三重实时荧光PCR方法应用于口岸截获的疑似象牙制品中，检测结果与现行标准方法结果一致，初步显示本方法可用于口岸截获疑似象牙制品的精准分子鉴定，可以快速有效鉴别现生象牙和猛犸象牙，为海关执法提供科学证据。

参考文献

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表1 4种象线粒体基因Cytb参考序列及合成质粒信息

Table 1 Reference sequences and synthetic plasmid information of four kinds of elephant mitochondrial Cytb genes

图1 亚洲象、非洲象（非洲草原象和非洲森林象）、猛犸象引物探针设计区域多重序列比对

Fig.1 Multiplex sequence alignment of primers and probes for Asian elephant, African elephant (African Savanna Elephant and Forest Elephant) and Woolly mammoth

表2 多重荧光PCR引物、探针

Table 2 Primers and probes used in multiplex real-time PCR

图4 三重实时荧光PCR特异性实验

Fig.4 The specificity test of triplex real-time PCR

M: DNA Marker (50～800 bp); 1～5: 口岸截获疑似象牙制品; 6～7: 阴性对照; 8～9: 阳性对照

图6 口岸截获疑似象牙制品的常规PCR检测结果

Fig. 6 Conventional PCR results of suspected ivory products captured at ports