基于psbA基因的北沙参分子鉴定-中国口岸科学技术-2022年08期

基于psbA基因的北沙参分子鉴定

作者：胡佳续刘勇张敏刘鹏王仲敏倪松廖芳张裕君

胡佳续刘勇张敏刘鹏王仲敏倪松廖芳张裕君

北沙参（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.），别称珊瑚菜，属于伞形科（Umbelliferae）、珊瑚菜属（Glehnia）的多年生草本植物，常用作中药材，在我国主要分布在东部及东南沿海省份，特别是在海滨沙滩分布最为集中^[1]。北沙参植株表面密被白色绒毛，由于生长在海边，北沙参进化出发达且细长的根系，以抵御海风常年的袭扰，根部长度为200～700 mm，直径为5～15 mm，表面为黄白色，整体呈纺锤形或圆柱形，而且北沙参根系储备大量养分，作为传统中药材，有滋阴润燥、甘甜清爽、清肺止咳的功效，药用价值非常高^[2-3]。由于北沙参分布地区不同，名称上存在差异，例如真北沙参、海沙参、野香菜根、辽沙参、条沙参等^[4]。北沙参作为名贵中草药，经济价值显著，近年来被大量采集挖掘，加之沿海城市或港口不断开发建设，破坏了其原始的生存环境，导致许多沿海区域的野生北沙参几乎消失绝迹^[5]。随着生存环境不断恶化，北沙参野生种群面临灭绝的危险，1999年8月4日，北沙参被列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》，保护级别为国家Ⅱ级重点保护^[6]。同时，北沙参作为伞形科植物的重要物种，其遗传信息具有较高的科研价值，对于分析东亚株系与北美株系的起源问题，以及了解伞形植物的系统发育都有一定科学意义。目前，北沙参野生种群数量仍处于下降趋势，通过监测普查发现，由于野生种群生长区域分布不集中，难以对其实施集中有效的保护措施，浙江部分地区野生资源已经灭绝，因此需进一步建立单项自然保护区，避免野生北沙参完全灭绝^[7]。

目前，DNA 分子鉴定已广泛用于物种的快速识别、分类鉴定、物种谱系地理学、资源识别、系统亲缘关系和系统进化研究等方面，相较于传统形态分类学，分子鉴定具有更加高效、准确的物种识别效率，特别是在中药资源鉴定、药材流通体系等方面应用广泛^[8-10]。针对植物材料，使用的目标基因有ITS基因以及叶绿体基因组基因，例如matK、psbA、rbcL、rpoB、trnL等^[11]。植物家族种类庞大，不同类群存在较大遗传差异，序列通用性差，不同的基因片段适合鉴定不同的植物样本，因此，筛选可靠准确的基因片段至关重要。ITS虽然拷贝多，易于扩增，但其序列差异性小、识别率低。由于植物内生真菌ITS基因干扰，常出现非特异性扩增现象，导致鉴定失败。植物体内叶绿体含量高，且容易提取和扩增，序列差异位点较为丰富，因此植物分子鉴定多选用叶绿体基因组片段。

2021年9月，天津海关植物检验检疫实验室采用 PCR 技术，核酸测序，数据库比对以及构建系统进化树等方法，对一批送检的植物样品进行分子鉴定。结果表明该植物样品为北沙参，保护级别为国家Ⅱ级重点保护，这是天津口岸首次截获北沙参。本文介绍了该样品的鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

样品为2021年9月天津海关截获的一批植物样品（图1），品名为中草药，外观为植物根茎，已剥皮，干燥状态，呈细长圆柱形或直条状，长15～30 cm，直径3～8 mm；外表呈淡黄色，略粗糙，整体质地较脆，容易弯折；中央木质部呈黄色放射状，圆环状形成层，深褐色；具有淡淡甘甜气味。样品于4℃保藏。

1.2 试剂与仪器

采用德国QIAGEN公司的植物基因组DNA提取试剂盒对植物样本进行核酸提取。使用大连TaKaRa公司的扩增试剂PCR Master Mix对植物DNA进行扩增，采用TaKaRa公司的Marker 2000作为分子量标准^[12]。研磨仪TissueLyserⅡ购自QIAGEN公司。

1.3 植物DNA提取

随机挑取20根样品，独立研磨，分别称取100 mg粉末，使用试剂盒提取样品DNA，于-20℃冰箱保存备用。

1.4 PCR扩增

使用PCR Master Mix进行核酸扩增。使用引物psbA-f/psbA-r（5'- GTTATGCATμGAACGTAATGCTC-3'/5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'）^[13]，对植物叶绿体基因进行扩增。反应体系（25 μL）：PCR Master Mix（2X）12.5 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板（30 ng/μL）1.0 μL，去离子水 9.5 μL。扩增程序：第一步，94℃，4 min；第二步，94℃，30 s，58℃，30 s，72℃，1 min，往复循环35轮；第三步，72℃，10 min。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5 序列分析及同源性比较

对PCR产物进行测序，由上海生工生物工程有限公司完成，利用 Dnaman8.0软件将测得序列进行装配拼接^[14]，登录美国国家生物信息中心进行序列同源性比较分析（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），采用 MEGA7.0软件进行序列多重比对以及系统进化树分析，使用最大相似法（ML）构建系统发育树，自举（Bootstrap）检验重复 5000 次^[15]。用于比较和建树的物种列包括北沙参及近源属物种白芷（Angelica dahurica）、朝鲜当归（Angelica gigas）、长鞘当归（Angelica cartilaginomarginata）、天目当归（Angelica tianmuensis）、康定当归（Angelica kangdingensis）。参考序列包括抽葶藁本（Ligusticum scapiforme）和多苞藁本（Ligusticumin volucratum）。

2 结果与分析

2.1 基因序列分析

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，PCR产物大小约300 bp的特异片段，将PCR产物测序，所有样品结果一致，扩增片段含有330个碱基对，碱基G+C的含量为34.3%（图2）。将该序列导入美国国家生物技术信息中心DNA序列数据库（GenBank），通过BLAST 程序对全数据库的序列进行一一比对，结果显示与北沙参基因序列相似度达到100%，与朝鲜当归（Angelica gigas）相似度为99.09%，与白芷（Angelica dahurica）相似度为98.80%，与天目当归（Angelica tianmuensis）序列相似度为98.49%，与其他植物的基因相似度均在98%以下（图3），表明该样本为北沙参。

2.2 系统树构建与分析

收集数据库中已有的北沙参及其近似种基因序列，与本样品所测定的基因序列进行同源性分析，使用MEGA7.0软件，构建系统发育树（图4），进化树的分支长度表示基因序列变化强度。由系统发育树可以看出，所收集的植物序列聚为5个大支，其中白芷与多苞藁本聚为一支、朝鲜当归聚为一支、天目当归聚为一支、抽莛藁本与康定当归聚为一支、样本与其他北沙参聚为一支，说明该样本为北沙参。

图4 基于psbA基因序列构建的系统NJ树

Fig.4 Phylogenetic tree of psbA nucleotide sequences

3 结语

目前关于北沙参的psbA基因同源性以及系统进化分析尚无报道。本研究首次通过PCR、多重序列比对及分子进化分析等方法，针对中药材北沙参的psbA基因进行分子鉴定，为保护我国珍惜濒危物种，为其进出口贸易管制规定提供技术支撑。

北沙参的鉴定大致分为经典鉴定方法、现代鉴定方法与应用鉴定方法，其中经典鉴定方法又可分为性状鉴定、显微鉴定和色谱鉴定。性状鉴定操作简单，可直接得出鉴定结果，但很难鉴别与真品外观或形状相似的伪品^[16]；显微鉴定方法可根据样品组织构造特征进行精准鉴定，但样品处理过程相对比较复杂，费时费力；色谱方法需要建立标准图谱或是数据库，预研成本比较昂贵。相比而言，分子鉴定技术重现性好，结果准确可靠，在植物学系统进化研究中发挥着重要作用。它以 DNA 序列为检测对象，样本选择不受时节和环境的限制，不受生长状态及器官组织差异的影响，有效扩大了样本的选择范围，而且可鉴定形态上很难或者根本无法鉴别的品种^[17-18]。

另外，本研究还针对北沙参其他基因，例如ITS、matK、rbcL、rpoB、trnL等进行分析比较，结果发现matK与trnL基因扩增成功率不高，而ITS、matK和rpoB序列分辨率不够，无法与其近似种区分开。北沙参psbA基因扩增效率高，且序列信息量大，能够有效区分其他物种，十分适合北沙参的物种鉴定及同源分析。