李井干 吴晶 刘晓宇 伏建国

西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根，味甘、微苦、性凉。西洋参主产于美国和加拿大，是我国进口药材的主要品种^[1]。我国应用西洋参的历史已经超过300年，清朝康熙年间的《补图草备要》中，便收载了西洋参，清朝乾隆年间的《本草纲目拾遗》中，也有西洋参的记载^[2]。我国于20世纪70年代后期引种栽培，80年代初引种栽培获得成功，目前在黑龙江、吉林、辽宁、陕西、北京、河北、山东等多个省市均有西洋参的栽培^[3]。

野生西洋参生长缓慢，需要7～8年才能开花结果，当前野生西洋参越挖越少，已濒临灭绝。《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）于1975年就将西洋参列入公约附录Ⅱ中，西洋参的整体、切片和部分，均受濒危保护。随着人们对保健、美容、延缓衰老的营养类补品需求不断增加，西洋参作为著名的补益、抗疲劳保健药材，现已成为消费热点。海关各旅、邮检口岸每年均查获大量非法携带、邮寄西洋参及其制品。由于西洋参市场需求量大，价格昂贵，市场伪品不断出现，尤以同科同属的人参Panax ginseng C.A.Mey冒充西洋参为多。目前，西洋参的主要鉴别方法有形状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等^[2]，但西洋参与近似种人参的药材性状、组织结构及化学成分十分相似，容易混淆，因此需要更为准确的鉴别方法。

濒危物种的准确鉴定是濒危物种保护的前提。DNA条形码（DNA barcoding）技术是利用生物体内一段或几段标准DNA序列实现物种快速、准确鉴定的新兴技术^[4]。DNA条形码技术已广泛应用于动物、植物、微生物等各生物类群的物种分类和鉴定研究中，在中药材鉴定方面也得到成功应用^[5-6]。Chen等^[7]选取了7个常用的DNA条形码候选序列（rbcL、matK、trnH-psbA、ycf5、ropC1、ITS1、ITS2），以6600余个药用植物样本作为研究对象，通过序列分析和物种鉴定研究，发现ITS2序列的种间鉴定率最高，达到92.7%，因此正式提出将ITS2作为药用植物的DNA条形码候选序列。基于ITS2序列制定了人参的分子鉴定方法^[8]，但是目前还没有可参照的西洋参分子鉴定方法。

本研究以查获的进境西洋参样品为研究对象，通过性状鉴别和基于ITS2序列的分子鉴定方法，研究进境西洋参的快速、准确鉴定方法，为口岸西洋参的准确鉴定提供可参照的技术方法。

1 材料与仪器

1.1 材料

供试样品：收集南京口岸2021年查获的54份进境西洋参样品。具体样品信息见表1。

1.2 仪器和试剂

Eppendorf PCR 仪（型号：epgradient S）；Bio-Rad电泳系统（型号：Sub-cell GT）；Bio-Rad凝胶成像系统（型号：Geldoc Go）；Sigma小型高速冷冻离心机（型号：1-16k）；植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；TaKaRa Premix Taq酶（货号：RR901）。

2 实验方法

2.1 性状鉴别

西洋参：外观多为纺锤状，直径0.5～2.0 cm，长2～6 cm，有或无芦头，无支根及须根；表皮黄白色或黄褐色，上部横环纹较细且清晰，纵皱较细，横长皮孔样栓化疤痕一般较细长，呈线形，微隆起；断面相对平坦，黄白或浅黄棕色，韧皮部与木质部交界处常有裂隙，形成层环附件颜色较深，形成层外围红棕色树脂道斑点多且明显；气微香而特异，味微苦且回甜。

人参：外观多为圆柱状，直径0.6～1.5 cm，长3～15 cm，有芦头和须根，芦头粗长；表皮灰黄色，较粗糙，上部或全体有疏浅断续的粗横纹及粗而深的纵皱纹，横纹多延至体的中下部，横长栓化疤痕突起一般不明显；断面平坦，淡黄白色，略显粉性，形成层环纹棕黄色，皮部黄棕色的点状树脂道斑点稀疏或不明显。

2.2 分子鉴定

2.2.1 DNA提取

先将供试样品表面消毒，按照天根植物DNA提取试剂盒说明书上的步骤方法，提取实验样品基因组DNA。

2.2.2 PCR扩增及测序

选用ITS2引物^[7]对提取的基因组DNA进行PCR扩增。正向引物ITS2F的序列为5'-ATGCGA TACTTGGTGTGAAT-3'；反向引物ITS3R的序列为5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。PCR反应体系（25 μL）包括：Premix Taq酶12 μL；正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL；模板DNA 2 μL；加入ddH₂O补充至25 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，38个循环；最后72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况，得到的产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2.2.3 序列比对分析

使用DNASTAR Lasergene 软件包中的Seqman程序对测序得到的序列进行组装和校对，去除低质量区和引物区，获得样品的ITS2序列。将ITS2序列在NCBI核酸序列数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上进行BLAST比对。各挑选两条NCBI数据库中西洋参和人参的ITS2序列，西洋参ITS2序列编号为MK087944.1、JF778873.1，人参ITS2序列编号为KX271137.1、MK087942.1，结合已测样品的ITS2序列，采用BioEdit软件比对分析西洋参和人参ITS2序列，寻找两者序列差异位点，作为西洋参和人参DNA条形码鉴定的依据。

3 结果与分析

3.1 样品鉴定结果

本实验共收集进境西洋参样品54份。其中，美国39份、加拿大9份、澳大利亚2份、新加坡2份及中国台湾地区2份。按规格分，11份为饮片，6份为无芦头、无须根的参段，1份为根须，1份为有芦头有须根的参段，其余35份为有芦头、无须根的参段。全部样品经DNA提取、PCR扩增及测序后，得到54条长度均为455 bp的ITS2序列。将测序得到的54份西洋参样品的ITS2序列到NCBI数据库进行比对，结果发现：来自新加坡的P22号样品与NCBI数据库人参的序列匹配率为100%，其余53份西洋参样品与NCBI数据库西洋参的序列匹配率为100%。由图1可以明显看出，样品P22号与样品P37相比，具有典型的人参形态特征：具长的芦头，具须根，表面较为粗糙，具粗而深的纵皱纹，粗横纹多且延至体的中下部。样品P37则是典型的西洋参形态特征：芦头较短，无须根，表皮较细腻，横环纹较细且多位于上部，横长皮孔样栓化疤痕明显。结合形态特征和BLAST结果，最终将P22号样品鉴定为人参Panax ginseng C.A.Mey，其余53份西洋参样品鉴定为西洋参Panax quinquefolium L.。具体鉴定结果见表1。

左: 西洋参样品P37 右: 人参样品P22

图1 西洋参和人参形态特征

Fig.1 Morphological characteristics of American ginseng and ginseng

3.2 ITS2序列变异位点分析

西洋参和人参的ITS2序列的长度均为455 bp，经过序列比对发现，西洋参在116号和127号位点出现点突变T和C，人参对应位点分别为C和T，具体情况见图2。53份西洋参样品和NCBI数据库西洋参的ITS2序列完全相同，说明这两处变异位点是稳定的，可用于西洋参和人参的DNA条形码鉴定。

4 讨论

西洋参和人参为同科同属的近缘种，外形很相似，所含成分也相近，易于混淆。由于西洋参的价格高于国产人参，因此存在将人参混入西洋参中，甚至直接以人参冒充西洋参的情况，且西洋参属于濒危物种，均要求我们采用科学的鉴别技术对两者进行区分^[9]。

DNA条形码技术是近年来物种分类和生物多样性研究的热点，因其操作简便、准确性高，在物种鉴定方面具有广阔的应用前景^[11]，逐渐成为濒危物种鉴定的重要工具^[12]。理想的DNA条形码应易于扩增，变异程度足以区分不同物种，且引物通用性好，能够通过双向测序得到高质量的序列^[13]。ITS2序列变异快，突变位点多且稳定，是最常用的植物DNA条形码之一。本研究发现，西洋参与人参的ITS2序列存在两处稳定的点突变，可将西洋参与人参进行准确区分，ITS2可作为西洋参鉴定的标准DNA条形码。

本研究中的54份进境西洋参样品的来源地有美国、加拿大、澳大利亚、新加坡和中国台湾地区。其中一批来自新加坡的西洋参样品，经鉴定为人参Panax ginseng C.A.Mey。美国和加拿大作为西洋参的原产国，是我国进口西洋参的主要货源地，查获的西洋参样品经鉴定均为西洋参Panax quinquefolium L.，西洋参掺杂的风险较低。而来自非原产国的西洋参，应作为重点检测对象，需要对查获的西洋参样品进行准确鉴定。同时54份进境西洋参样品规格形态多样，有饮片、根须、参段，参段也有长短、有无芦头、有无须根之分，仅靠形态鉴别的工作难度较大，需要与分子生物学方法结合，保障进境西洋参的准确鉴定。

本研究通过样品DNA提取、ITS2序列扩增、序列比对和形态鉴别，对进境的54份西洋参样品进行了准确鉴定，建立了西洋参的形态鉴别与分子鉴定相结合的鉴定方法。该方法操作简便、鉴定准确，可应用于口岸查获西洋参的快速准确鉴定，为口岸西洋参鉴定工作的标准化、规范化建设提供实验依据，也为区分西洋参与其他伪混品提供鉴定依据。进境西洋参的鉴定不仅是用药安全的需要，同时对物种资源尤其是濒危物种的保护也具有重要意义。本研究只对西洋参和近似种人参进行了区分，西洋参和人参属其他种的区分还需要进一步研究。

参考文献

基金项目：南京海关科研项目（2021KJ38）

第一作者：李井干（1987—），男，汉族，山东滕州人，硕士，农艺师，主要从事外来物种鉴定研究，E-mail: 570109771@qq.com

1. 南京海关动植物与食品检测中心 南京 210019

1. Animal, Plant and Food Inspection Center, Nanjing Customs, Nanjing 210019

表1 样品信息表

Table 1 Sample information

表1（续）

图2 ITS2序列突变位点

Fig.2 Mutant site of ITS2 sequences