丹参种质多样性及鉴定研究进展-中国口岸科学技术-2022年08期

丹参种质多样性及鉴定研究进展

作者：廖芳任瑞花孔德英刘伟李关荣

廖芳任瑞花孔德英刘伟李关荣

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge.）属唇形科（Labiatae）鼠尾草属（Salvia），别名红根、赤参，是一种主要以根及根茎入药的多年生草本植物^[1]。丹参药用历史悠久，药理作用广泛，具有镇静安神、消肿止痛、活血通经、祛瘀止痛等功效^[2]。最新研究表明，丹参对心血管疾病效果明显，是治疗冠心病最常用的中药之一，丹参还对肿瘤、肝纤维化、艾滋病等疾病亦显现出一定疗效^[3-5]。此外，丹参叶中富含益于健康的酚类物质，被认为是食品、药品、化妆品和营养品行业天然抗氧化剂的新潜在来源^[6]，年需求量超2万t，是我国40种常用大宗药材之一。在日本和欧美国家，丹参被广泛用于心脑血管疾病治疗^[7]。世界范围内对丹参的需求量迅速增长，使得丹参野生资源受到严重破坏，丹参的随意引种、种植管理不规范，以及种植规模逐年扩大，产生了种源混乱、品种混杂、质量不稳、遗传多样性研究难度高等问题^[8]。

生物物种资源具有潜在的生态价值和经济价值，是国家可持续发展的重要战略资源，植物遗传资源流失在我国生物资源引出和流失中占相当大的比重，尤其是优质野生植物资源的流失极易成为发达国家的反制技贸措施而受制于人。本文对丹参种质多样性及鉴定的研究进展进行了系统综述，对存在的主要问题进行分析，并提出进一步研究建议，为丹参种质资源的分子鉴定、丹参种质资源的保护、避免丹参优良野生种质资源的跨国流失以及丹参的遗传改良与新型优良种质培育提供参考。

1 丹参种质资源

1.1 种内变异

丹参分类学上有2个变种和1个变型，包括原变种S. miltiorrhiza var. miltiorrhiza、单叶丹参变种S. miltiorrhiza var. charbommellii和白花丹参变型S. miltiorrhiza f. alba，白花丹参为优良品种，其药用有效成分二萜醌类含量高于紫花丹参（原种）^[9]；根据生产方式特点又分野生和家种2种商品规格，一般野生品有效成分高于栽培品，白花丹参野生种主要分布在山东泰沂山脉，是山东道地药材，其有效成分丹参酮ⅡA、丹酚酸B含量较高，经过长期的人工栽培和有性繁殖，出现了很多如野生型、大叶型、小叶型和不育型等生态变异类型^[10]；根据产地可分为鲁丹参和川丹参两大道地品牌，当前存在生产上丹参药材品种良莠不齐、栽培技术不规范、正品丹参道地性研究不足、炮制方法不当等问题，以至于同种药用丹参有效成分含量出现较大差异，影响丹参产量和质量^[11]。

1.2 道地药材

道地药材是指具有特定的产区、种质、生产技术和加工方法所生产的优质中药材，道地性一直是评价药材品质的独特综合性标准。丹参主要道地产区有河南、山东、陕西、湖北、安徽、四川等地，有栽培也有野生，道地药材无序异地移栽是导致药材质量下降、“古方失效”的一个重要原因^[12]，当前多种分子生物学技术应用于道地药材的研究，一定程度上揭示了药材道地性与产地的相关性。

1.3 资源分布

丹参对土壤气候适应性强，喜气候温和、空气湿润、光照充足的地方，其主要生长于山坡、草地、林下等处，广泛分布于我国华北、华东、中南、西北及西南的部分省区。随着丹参需求的大幅增加及野生资源的迅速减少，丹参药材主要来源于栽培品，栽培区域分布较广，栽培丹参的主产区有山东临沂、河南焦作、山西万荣、陕西商洛、四川中江等地^[13]。

1.4 种质资源现状

丹参种质资源丰富，品种繁多，复杂多样，野生和栽培居群都存在很多变异类型，这些变异类型与产地和人工选育有关，随着丹参需求量增大，各地随意引种及栽培面积的剧增使得丹参种质资源混杂，品质极不稳定，严重影响着丹参药材的质量稳定性^[9]。造成其种质资源多样性的原因有两方面：一是丹参独特的繁殖特性是造成种质资源多样性的主要原因，它的雌雄同株花全年生产，异花授粉发生率很高^[6]；二是丹参的广泛栽培和地理适应，使其存在较高的突变率^[9]，影响到该物种的遗传多样性，这既使得种质资源丰富，又使其资源鉴定较为困难。

2 丹参种质资源鉴定

近年来，丹参的种质资源研究越来越受到重视，不少学者在种质资源鉴定、药材质量评价、遗传多样性等方面开展了大量研究。

2.1 形态学特征

形态学特征是基因的具体表征，是生物学性状的综合表达。形态特征主要是生物在生长发育过程中所呈现的表型、生物学特性等可直观识别的特征，显著特点就是直观，能够进行明确观测且对各性状易于标准化，在药用植物种质鉴定方面发挥着重要作用。我国丹参分布广泛，长期适应各种生态环境因子和气候条件，产生多种类型的遗传分化。Peng等^[14]选取11个质量性状和20个数量性状对丹参种质资源生物学性状变异进行了研究与评价，结果表明，31个性状变异程度明显，显示不同形态丹参种质间存在丰富的多样性。王萌等^[15]研究结果表明根部显微结构特征可作为指标用于鉴别丹参产地及种质特性。张兴国等^[16]研究建立了著名道地药材川丹参大叶型、小叶型和野生型品种资源特性分型研究的性状指标体系，川丹参的优质高产品种为小叶型丹参，利用具有繁殖能力的川野丹参品种资源填补了栽培川丹参不能有性繁殖的研究空白。由于形态学标记容易打上环境影响及人为印记，某些情况下形态变异很难完全真实反映内在的遗传变异和遗传多样性关系，形态学标记须结合其他标记手段。

2.2 活性物质及其化学指纹

为确保药材质量的可靠和可控，须选择优良种质进行药材规范化栽培，其中药材有效成分含量是药材种质评价的首要指标。丹参的活性成分主要含两大类：脂溶性成分丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ（ⅡA、ⅡB）、隐丹参酮等，水溶性成分原儿茶酸、丹酚酸A和丹酚酸B等^[17]。《中华人民共和国药典》中丹参质量标准中指标性成分是丹参酮ⅡA、丹酚酸B。翟宏宇等^[18]采用HPLC法建立了不同产地丹参的特征图谱，并对其6种特征成分（丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、二氢丹参酮I、隐丹参酮、迷迭香酸、丹酚酸 B）进行含量测定，结果显示这6种成分在各自范围内线性关系良好，该方法可有效控制丹参质量。郑梦婷等^[19]研究表明不同产地丹参中野生品的丹参酮ⅡA含量均高于栽培品。宋嬿等^[20]研究了丹参主产区不同产地栽培与野生丹参的活性成分含有量，结果表明不同产地丹参药材，无论栽培品还是野生品，脂溶性成分丹参酮ⅡA、隐丹参酮和水溶性成分丹酚酸B、迷迭香酸等4种活性成分的含有量均存在较大差异，聚类分析表明多数产地丹参药材栽培种与野生种能够明显区别。周晓丽等^[21]对5个道地产区及3个非道地产区丹参的丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参素钠3种有效成分进行了含量测定，结果表明不同产地的丹参样本成分含量差异明显，山西、河南、山东3个道地产区丹参药材有效成分含量较高，湖北和四川2个道地产区和河北、北京2个非道地产区丹参有效成分含量相对较低，内蒙古野生丹参的脂溶性成分远高于其他产地人工栽培品种，但水溶性成分丹参素钠却是所有检测样本中含量最低的。

丹参活性成分多为植物次生代谢物，其含量很大程度上受到生长环境各因素的直接或间接影响，脂溶性成分和水溶性成分随产地、品种以及野生或家种等因素呈现较大差异。

2.3 DNA分子标记

传统的种质资源鉴定方法主要基于性状和有效成分分析，药材的形态学鉴定需要具有扎实的基础知识和长期的实践经验，而且植物性状与生长发育阶段和生长环境有很大关系，鉴定准确性不高。基于有效成分含量的种质鉴定也易受到生境影响呈现出复杂变化，分子生物学技术的迅猛发展，给中药现代化研究注入了新活力，DNA分子水平上揭示多态性的分子标记被认为是研究植物遗传多样性的有力工具，可以区分不同来源的不同形态个体，被广泛用于药用植物的居群鉴别及种间鉴别^[22]。丹参种质资源鉴定主要采用随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性DNA（AFLP）、SSR（简单重复序列标记）、相关序列扩增多态性（SRAP）等DNA分子标记技术。

2.3.1 随机扩增多态性DNA标记（RAPD）

扩增产物的多态性反应了基因组的多态性。RAPD 技术曾广泛应用于生物系谱分析及进化研究和品种鉴定^[23]。郭宝林等^[24]等采用RAPD技术研究四川、河南、河北、山东、山西等地丹参材料主要居群的遗传关系及药材道地性，发现丹参居群内具有丰富的遗传多样性，河南和山东栽培居群源自当地野生居群，还没有进行人工选择。地区间居群的遗传分化不均衡。石嫱等^[25]所建立的RAPD体系可用于评价内蒙古产丹参药材质量。虽然RAPD技术简单方便，但较低的稳定性和重复性限制了其使用^[26]。

2.3.2 功能基因分子标记

功能基因分子标记主要有：扩增片段长度多态性（AFLP）、基于表达序列标签开发微卫星标记（EST-SSR）和简单重复序列间扩增标记（ISSR）以及相关序列扩增多态性（SRAP）等。

AFLP分子标记广泛用于种质遗传多态性和作物品种鉴定研究。丹参居群内部具有丰富的遗传多样性，郝岗平等^[27]采用AFLP技术研究了山东地区的15个丹参样本的DNA多态性，结果表明白花丹参和丹参遗传相似性较低，遗传关系较远，临沂地区栽培和野生丹参样本虽聚在一起，但两者之间具有一定的遗传差异，说明山东产丹参具有一定的遗传多样性，AFLP技术可进一步用于丹参道地性以及居群差异的鉴别。唐晓清等^[28]用7对引物对丹参种内的皱叶丹参、单叶丹参、小叶丹参和丹参原型等4类丹参进行AFLP分析，结果显示，丹参种内不同类型间遗传差异较大，且遗传多样性丰富，聚类结果初步表明可以将小叶型丹参确定为一个变种，皱叶型丹参与丹参原型也可定为丹参的栽培变种，认为AFLP技术可用于鉴别丹参种内的不同类型。王冰等^[29]用AFLP分子标记技术研究了我国27个不同地理居群的丹参样本，发现野生居群间存在较高多态性，遗传多样性较为丰富，具有地理起源渐变群的显著特点，不同丹参居群间的遗传距离与空间距离关系复杂，白花丹参可定位为丹参的不同地理变型，AFLP 技术在丹参种质资源鉴定上具有高分辨率，能用于丹参种内不同类型的分类、演化及其与地理分布间关系的研究。温春秀等^[30]分析了55份丹参的遗传多样性，揭示了同一产地的丹参也具有丰富的遗传变异，进一步证明AFLP方法对丹参种质的遗传多样性的检测效应很高。AFLP由于具有快速性、可重复性和丰富的多态性，现广泛用于基因组指纹识别，但有两个主要缺点是费用过高和程序繁琐^[26]。

邓科君等^[31]利用丹参的表达序列标签（EST）序列设计开发EST-SSR引物，对13个不同居群丹参样品进行了分析，发现丹参居群间具有丰富的遗传多样性，野生和栽培居群分化明显，表明EST-SSR分析可揭示丹参不同水平的遗传多样性。宋振巧等^[32]开展了4个产地80个丹参种质资源的多样性水平测定和聚类分析，证明EST-SSR能有效检测丹参的遗传多样性，但遗传距离与地理分布之间的关系未达显著相关性。王海等^[33]采用SSR分子标记分析了全国31个不同丹参居群叶绿体基因的遗传特性，认为丹参种质间存在广泛的基因交流，遗传变异以种群间为主，需要采取措施保护道地产区的种质特性。

ISSR方法已被广泛用于快速检测遗传多态性，区分密切相关的栽培种，鉴定种质和鉴定品种^[34-35]。徐红等^[36]联用RAPD与ISSR标记分析不同产地野生和栽培丹参的遗传背景，结果表明不同产地野生与栽培丹参遗传多态性丰富，栽培丹参遗传多态性高于野生丹参，各产地栽培丹参表现不尽相同，丹参种质变异类型丰富，不同产地呈现明显的遗传分化。宋振巧等^[37]利用ISSR分子标记研究了山东5个居群72份丹参株系的群体遗传结构，比较了其遗传多样性，为制定原位种质保护计划指出了方向。ISSR技术结合了AFLP和SSR标记的大部分优点，实现了比RAPD更高的重现性，检测到比限制性片段长度多态性（RFLP）更高百分比的基因组多态性，并且比AFLP便宜^[38]。

相关序列扩增多态性（SRAP）技术基于不同物种的内含子、启动子与间隔区长度不同产生多态性。丹参药材质量与丹参功能基因及表达相关，因而，利用SRAP分子标记可以对丹参进行种质的多态性分析，并且找出道地品质。李廷春等^[39]利用SRAP分子标记技术研究了5个主产区的丹参遗传多样性，结果表明不同丹参种群间具有复杂的遗传距离与空间距离关系。王维婷等^[40]利用SRAP分子标记研究不同来源丹参种质的遗传多态性，结果显示地区间丹参种质的遗传分化不均衡，遗传距离随着驯化程度的增加而增加，据此推测品种不规范的选育方式可能是造成栽培丹参药用品质下降的原因。宋振巧^[41]联用ISSR和SRAP分子标记技术研究了山东省内外9个栽培丹参居群的群体遗传结构及遗传多样性，认为居群内变异程度高于居群间，山东省丹参资源的遗传多样性大于省外，居群间的遗传距离与空间距离具有一定的相关性。

其他诸如目标区域扩增多态性（Target Region Amplified Polymorphism，TRAP）、甲基化敏感扩增多态性（Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP）等新型功能基因分子标记技术在丹参种质鉴定上也有应用。王庆浩等^[42]利用TRAP标记技术对四川、河南、江苏和陕西的丹参进行聚类分析，证明4个产地的丹参亲缘性较高，居群内既蕴藏遗传变异又保持较高遗传稳定。褚会娟等^[43]利用MSAP技术研究了陕西5个野生丹参居群表观遗传多样性，发现野生丹参的遗传多样性十分丰富，4个原生居群都能按照地理分布聚成相对独立的分支，没有交叉，耕作活动频繁采样地的10个单株却未能聚在一起，人为因素可能打破地理隔离，促成基因的异常流动。张逸等^[44]分别采用AFLP和MSAP两种分子标记技术研究了秦巴山区5个野生居群的遗传多样性和表观遗传多样性，发现野生居群间的亲缘关系与地理分布具有明显相关性，丹参变异主要存在于居群内。

以上多种分子标记各有优缺点，可以多种分子标记相结合或与传统的形态学标记、生物化学标记相结合，进而建立准确、简便、快速的丹参鉴别方法。目前各种分子标记技术用于丹参种内分类、演化及其与地理分布间关系的研究，为丹参种质资源的收集保存、分类鉴定、合理开发利用与品种选育等提供科学的理论依据，同时为建立丹参道地药材及其优良品种的DNA指纹图谱奠定了一定基础。丹参具有较高遗传多样性，但遗传多样性多表现在居群内，不同来源丹参之间的亲缘关系尚不十分明确，居群间的亲缘关系与其地理分布的相关性，不同学者结论不同，这可能与研究者选用分子标记方法、研究材料来源、数目等有一定关系。此外，栽培丹参由于存在引种选育等人为因素影响，与地理分布的关系更为复杂。

3 结语

丹参属于多年生异花传粉植物，生态适应强，分布广泛，种植历史长，具有世代重叠特征，遗传多样性丰富。不同居群或不同产地丹参的遗传多样性，既体现在形态特征方面，也体现在蛋白质与DNA分子水平上，活性成分种类与含量也有差异。由于取样数量、地点等不同，形态、有效成分及分子标记等各种技术手段分析与聚类结果可能不相吻合，但总体显示出其遗传多样性具有地理起源渐变群的特点，相隔较远的种群分化程度往往较大。

我国丹参种质资源丰富，药用历史悠久，药理作用广泛。但对其保存、评价和利用研究不足，存在种质资源管理和利用不当等问题，直接影响到丹参药材的种质资源特别是野生资源的保护、品种道地性鉴定。虽然目前研究者对丹参种质资源的化学指纹、DNA指纹鉴定以及其质量控制等方面做了大量有益的工作，但迄今尚不能完全实现对丹参种质资源材料的分子溯源鉴定，更不用说难度和复杂度更高的地理溯源。

近年来，DNA分子标记在中药种质资源与道地性评价、药用植物的分类与亲缘关系研究以及中药材品种与真伪鉴定等领域开展了大量研究，利用分子标记技术研究种质资源遗传背景和化学成分相关性，构建丹参的遗传连锁图谱，与丹参重要品质性状的分子标记开发及利用分子标记辅助育种必将成为丹参分子标记相关研究的重点。

为了避免以优充次逃避海关检验造成优质资源流失及影响丹参药材的生产质量，要实现对丹参种质资源的真正保护。首先，国家应当建立开放式丹参种质资源库，丹参种植者和丹参研究人员可以从权威机构获得真实可信的丹参材料信息，为丹参引种、栽培和研究服务；其次，进一步强化丹参生物学和种质资源鉴定研究，鼓励基于丹参重要功能基因，特别是主要有效成分合成酶类相关功能基因的DNA指纹研究，结合相应化学指纹，力图找到不同品种乃至质量控制的综合性分子指纹标记。因为这些功能基因的DNA指纹和相应化学指纹最能直接反应不同丹参品种的遗传本质和药用品质特性。这样才能实现丹参种质资源的分子溯源鉴定、资源保护以及资源开发利用的可持续发展。

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基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFF0210303，2017YFF0210305）

第一作者：廖芳（1973—），男，汉族，四川达州人，博士，研究员，主要从事植物检疫及物种资源保护，E-mail: liaoxyfang@163.com

通信作者：李关荣（1963—），男，汉族，四川营山人，教授，主要从事资源植物研究，E-mail: grli@swu.edu.cn

1. 天津海关动植物与食品检测中心天津 300461

2. 西南大学农学与生物科技学院重庆 400716

3. 重庆海关技术中心重庆 400020