高旗利 刘培 王乃福 张 静 杨爽 王飞 赵良娟 张骏

肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）为革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌属（Klebsiella），是兼性厌氧菌，无鞭毛，无动力，有较厚的荚膜，多数菌株有菌毛，具有菌体抗原、荚膜抗原及苗毛抗原等多种主要抗原成分，属于大肠菌群成员之一。目前食品中的肺炎克雷伯氏菌污染问题已逐步受到关注，许多国家都在对该菌进行研究，以便建立科学的政策与控制措施。

自1997年国际食品法典委员会（Codex alimentarius commission，CAC）制定了《微生物风险评价的原则和指南》的国际标准以来，食品安全微生物风险分析已成为当前国际社会普遍应用并进行食品安全管理的有效工具之一^[1-2]。应用食品安全微生物风险分析手段对奶粉中肺炎克雷伯氏菌进行风险分析评估，将有利于更好地对乳粉进行安全管理。本文基于大量文献报道和天津海关动植物与食品检测中心微生物实验室调研数据，客观地提出了乳粉中肺炎克雷伯氏菌风险评估报告，以期为我国相关部门制定乳粉安全政策提供科学依据，助推我国乳粉安全工作向前发展。

1 危害识别

1.1 肺炎克雷伯氏菌对人类的危害

肺炎克雷伯氏菌为最重要的条件致病菌之一，是人类呼吸道及肠道的常居菌群，但不属于正常菌群，广泛分布于自然界，存在于水和土壤中。当机体免疫力低下或降低时易引起感染。2001年5月—2002年5月，从郑州儿童医院腹泻病例中，共检出机会菌感染粪便458例，在肠道菌选择性培养基上，纯培养出肺炎克雷伯氏菌株136株，占39.69%^[3]；1995年10月—1998年9月，从湖北省妇幼保健医院404例腹泻粪便中培养证实为肺炎克雷伯氏菌感染的小儿肠炎53例^[4]；2001—2002年，从天津市第四中心医院检验科送检的26份婴儿腹泻粪便中，检出24份肺炎克雷伯氏菌阳性^[5]；2007年，李玉凤等^[6]报道广东省东莞市5岁以下肺炎患儿病原菌以肺炎克雷伯氏菌为首。除腹泻外，肺炎克雷伯氏菌还是肺炎、肝脓肿、脑膜炎、脊髓炎、败血症、结肠炎的病原菌^[7-15]。上述调查表明，肺炎克雷伯氏菌对人类尤其是对婴幼儿是一种重要的致病菌。

1.2 乳粉中肺炎克雷伯氏菌的来源

乳粉是肺炎克雷伯氏菌的重要载体。近年来，由肺炎克雷伯氏菌引起的食物中毒越来越多，据美国疾病控制中心报告，由肺炎克雷伯氏菌引起的食物中毒居第6位，占整个细菌性食物中毒的8%^[16]，我国每年发生该菌引起的食物中毒事件也较多。肺炎克雷伯氏菌对乳粉加工业存在着潜在危害^[17-19]。

本实验室曾从不同环境和食物中分离出该菌，如水、鲜牛乳、乳清粉、蛋白粉、DHA粉、面包、豆腐、奶茶、奶酪、牛肉、猪肉、香肠、蔬菜、蔗糖等食品中及食品加工台面、土壤、医学生物媒介及粪便等环境中。因此，水、鲜牛乳、乳清粉、蛋白粉、DHA粉、蔗糖及其他配料等都是乳粉中肺炎克雷伯氏菌的直接来源。本实验室还从2个乳粉厂取了100个环境样品和工人手样，其中12份样品分离出肺炎克雷伯氏菌，因此，乳粉生产环境和人员是乳粉污染肺炎克雷伯氏菌的间接原因。

1.3 肺炎克雷伯氏菌的生存条件

温度-生长试验结果表明：肺炎克雷伯氏菌能在较宽的温度阈内生长（20～45℃），其在复原乳中，25℃、37℃的代时分别为55 min、25 min，15℃以下不生长，可见肺炎克雷伯氏菌相对于其他的肠杆菌科细菌代时较短。因此，室温下复原奶中如果含有少量的肺炎克雷伯氏菌，较短时间内就能大量增殖，从而威胁健康，为防止增殖应低温保藏。

冲调试验表明：55℃冲调乳粉，肺炎克雷伯氏菌含量减少2个数量级，而杀灭肺炎克雷伯氏菌须在65℃下冲调。为了防止营养成份的破坏，一般速溶乳粉冲调的建议温度为55℃，但该温度不能保障乳粉安全。

水活度的高低对乳粉质量影响较大，该指标是评定奶粉质量的关键指标，一般规定乳粉水活度在0.2～0.35之间。如果水活度过高，乳粉则易变色、变味，溶解度降低或残留细菌增殖；如果水活度过低，不仅产生氧化味，而且经济上也受损失。

干燥试验表明：水活度在0.23～0.41范围内乳粉中肺炎克雷伯氏菌在2个月时，含量仅降低了2个数量级。可见肺炎克雷伯氏菌具有很强的抗干燥性，这可能由于该菌形成荚膜，其犹如盔甲可有效保护菌体不仅免受多种杀菌、抑菌物质的损伤，还可以帮助菌体抵抗干燥对生存的胁迫^[20]。

Anthony等^[21]对水中致病菌的耐热性的研究表明肺炎克雷伯氏菌的D55为22 s，肺炎克雷伯氏菌不耐热，本实验室通过对10株肺炎克雷伯氏菌的试验测定（D55为20～30 s），进一步表明肺炎克雷伯氏菌抗热胁迫能力不强。因此，在生产环节中，若严格执行杀菌工艺可以避免主料造成的污染，但分析婴儿配方乳粉的加工工艺，鲜牛乳、蔗糖、乳清粉、乳脂等主料在预处理工序中经过了巴氏杀菌，但维生素、微量元素及其他辅料等不耐热成分则是在巴氏杀菌后添加的，因此，还会带入潜在危害。另外，小型或作坊式的乳粉加工厂采用的是干法工艺，即原料干粉直接配制，没有巴氏杀菌工序，潜在的危害更大。

2 特性描述

肺炎克雷伯氏菌存在于人类肠道、呼吸道以及水和土壤中，当机体免疫力降低或长期大量使用抗生素导致菌群失调时易引起感染。常见有腹泻、肺炎、支气管炎、泌尿道和创伤感染，有时引起严重的败血症、脑膜炎、腹膜炎等，是除大肠杆菌外的医源性感染最重要条件致病菌。肺炎克雷伯氏菌对机体免疫力低下或降低的人群发病率较高，婴幼儿是该菌的最大受害人群，其次是老年人和长期使用抗生素导致菌群失调的人群。腹泻是婴幼儿的常见病、多发病，在我国腹泻是居第2位的小儿常见多发病，也是导致婴幼儿死亡的主要原因之一，据WHO统计每年全球约400万婴幼儿死于腹泻。目前婴幼儿腹泻从病因上可分为感染性和非感染性腹泻两大类，前者可由细菌、病毒、霉菌、寄生虫感染引起，后者主要是由饮食因素和气候因素导致，根据文献报道在小儿感染性腹泻中肺炎克雷伯氏菌占18.37%，位于首位^[22]。世界卫生组织将小儿肺炎列为3种重要儿科疾病之一，小儿肺炎死亡率占整个儿童死亡的20%以上，尤其是婴幼儿死亡率更高，肺炎克雷伯氏菌是引发小儿肺炎的主要病原体之一^[23]。

近年来，由于大量广谱抗生素广泛和不合理的使用，使细菌耐药趋势日趋严峻，临床常见病原菌对各种抗菌药物耐药率呈不断上升的趋势，给感染性疾病的抗菌药物临床治疗带来很大困难。细菌的耐药性问题已成为临床医生和临床微生物工作者所关注的热点问题。革兰阴性杆菌是细菌感染的主要病原菌，其耐药机制主要是由于产生染色体或质粒介导的β-内酰胺酶，即高水平表达染色体编码的AmpCβ-内酰胺酶（AmpC酶）和质粒介导的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）。肺炎克雷伯氏菌是产生AmpC酶和ESBLs的典型菌，有些肺炎克雷伯氏菌菌株同时产生AmpC酶和ESBLs，称之为超超广谱β-内酰胺酶（SSBLs）^[24]，该类菌株的耐药性更强，传播更广，临床治疗更难。

关于肺炎克雷伯氏菌的致病机制，目前尚不十分清楚，研究比较多的是肺炎伯克雷伯氏菌的荚膜多糖（CPS），实验已经证明CPS是肺炎克雷伯氏菌引起感染性疾病的主要毒力因子。肺炎克雷伯氏菌还产生不耐热和耐热毒素、粘附因子和脂多糖，通过上述毒素因子，可使肠粘膜消化和分泌功能障碍而导致腹泻^[25]。有研究资料表明，根据血清学试验，导致婴幼儿腹泻的菌型与健康带菌者不一致，具有流行病学意义^[26]。

本实验室曾用肺炎克雷伯氏菌的肉汤培养物对小白鼠进行致死试验，只需皮下注射0.01 mL，即可在24～28 h内致死，0.01 mL腹腔注射，24 h内死亡；10² CFU/mL菌悬液，灌胃0.2 mL，2 d后小白鼠出现腹泻现象，4 d后相继死亡；10¹ CFU/mL菌悬液，灌胃0.2 mL，1/3小白鼠出现症状。危害描述的关键是要针对易感人群建立理想的剂量－反应关系，但目前尚无肺炎克雷伯氏菌剂量－反应的报道，可参考与之致病性和敏感人群相似的另一条件病原菌，即阪崎肠杆菌。Havelaar等^[27]认为含有低量阪崎肠杆菌的奶粉溶液在37℃，大约只要2 h就能使超过1/1000的婴儿患病。因此，婴儿乳粉中肺炎克雷伯氏菌的限量就应该定为不得检出。本实验室对乳粉中肺炎克雷伯氏菌检测时发现，该菌在乳粉中分布极不均匀，可能在一次哺喂的乳粉中集中了该袋乳粉全部肺炎克雷伯氏菌，从而引起婴儿患病。

3 乳粉中肺炎克雷伯氏菌暴露评估

Muytjens等^[28]对35个国家141份婴儿奶粉中肠杆菌科污染情况进行了调查，按污染概率，依次为团聚肠杆菌（35份）、阴沟肠杆菌（30份）、阪崎肠杆菌（20份）、肺炎克雷伯氏菌（13份）、弗劳地枸橼酸杆菌（5份）、大肠埃希氏菌（4份）、产酸克雷伯氏菌（4份）、差异枸橼酸杆菌（3份）、蜂房哈夫尼亚杆菌（1份）。肺炎克雷伯氏菌污染量为（0.19～46.22）CFU/100 g。

本实验室收集从天津口岸进境的100份分别来自新西兰、爱尔兰、法国、澳大利亚、芬兰、荷兰、比利时、美国、丹麦、印度、乌克兰等国家的原料乳粉，以及国内市售的10种不同品牌的婴儿配方乳粉各5份，总计150份乳粉，采用SN标准^[29]进行该菌污染情况普查，结果显示：100份进境乳清粉中，检出肺炎克雷伯氏菌7份，染菌量为0.36～24 CFU/100 g；50份国内市售婴儿配方乳粉中，检出肺炎克雷伯氏菌2份，染菌量为0.36～2.3 CFU/100 g。普查结果表明乳粉中肺炎克雷伯氏菌污染概率较高，但含量较低。肺炎克雷伯氏菌为大肠菌群成员之一，根据GB 19644-2010《食品安全国家标准 乳粉》及GB 10765-2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》之规定大肠菌群的限量为n＝5，c＝2，m＝10 CFU/g，M＝100 CFU/g，标准限量高于实际染菌量，现行标准不能确保乳粉安全，应该另外规定肺炎克雷伯氏菌不得检出。

4 检测方法

目前乳粉中肺炎克雷伯氏菌检测方法分为2种。一种是传统的培养分离方法，另一种为仪器方法。

传统检测方法为本实验室制定的检验检疫行业标准，检测量为300 g（n＝3），根据克雷伯氏菌发酵肌醇、阿东醇及耐受羧苄青霉素的生化特性研制出了分离效果良好的麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素培养基（MIAC），提高了分离培养基的选择性。

用于肺炎克雷伯氏菌检测的仪器方法较多，主要有实时荧光PCR^[30-31]、16S-23S rRNA Spacer序列分析^[32]、环介导等温扩增^[33]、以及MALDI-TOF MS^[34]等方法。这些方法对于该菌引起的传染病防控和食品污染控制发挥了重要作用。

本实验室根据肺炎克雷伯氏菌16S-23S rDNA间区序列（ITS）设计和筛选出了1对引物，建立了肺炎克雷伯氏菌的SYBR Green Ⅰ荧光染料PCR方法，从而对乳粉中是否污染肺炎克雷伯氏菌进行快速检测。

5 降低乳粉中肺炎克雷伯氏菌风险的建议

避免乳粉特别是婴儿乳粉中肺炎克雷伯氏菌的危险性，需要政府、乳粉生产者、消费者共同关注和努力，并给予充分重视。2004年，国际食品卫生法典委员会（CAC）的年会上，已将阪崎肠杆菌、克雷伯氏菌等列为风险因子，要求成员国严格监控，保障婴儿配方乳粉哺喂的安全性。目前，在多数国人对乳粉中新出现的肺炎克雷伯氏菌的危害、污染情况、风险管理措施缺乏科学认识，且尚无乳粉中肺炎克雷伯氏菌检测方法及限量的国家标准的现状下，提出如下建议：一是完善和修订乳粉安全的标准体系，尽快出台相应的国家检测标准和修订现行的国家卫生标准，在标准文本中应该规定肺炎克雷伯氏菌不得检出；二是建议改造和关闭干法生产婴儿配方乳粉的小加工厂；三是质检部门不仅要对成品进行检测和监管，还要对原料进行检测与监管；四是乳粉生产者改进工艺和加工环境卫生，严格执行良好的操作规范和良好的卫生规范；五是对于婴儿等高危消费群，乳粉生产者研究和生产超高温液态配方奶替代配方乳粉；六是向消费者宣传速溶乳粉不是无菌的，而是存在致病菌风险因子的，并让消费者了解适宜的冲调温度和复原乳的保存温度，防止因未采用合适温度冲调，或未在合适的温度下储存复原乳造成的危害。

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第一作者：高旗利（1964—），男，汉族，天津人，研究员，主要从事食品微生物检测与研究，E-mail: gaoqilitjciq@163.com

通信作者：张骏（1982—），男，汉族，江苏南京人，高级工程师，主要从事食品安全监管及检测技术研究，E-mail: happyjackey1234@163.com

1. 天津海关动植物与食品检测中心 天津 300041

2. 天津市市场监督管理委员会 天津 300070

1. Tianjin Customs Animal Plant and Foodstuffs Inspection Center, Tianjin 300041

2. Tianjin Administration for Market Regulation, Tianjin 300070