黄河清 吴影仁 李萍 宋志平 梁柱伟 钱冽 高瑞芳

石斛类药材为我国名贵传统中药材，《中国药典》（2020年版）记载为兰科石斛和铁皮石斛2种。在我国传统医学当中，石斛具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳的功效^[1-3]。铁皮石斛作为其中的翘楚，更是具有“中华九大仙草之首”的美誉，近年来越来越受到人们的关注，也催生了保健品等相关产品的热销。诱人的经济效益伴生了市场上铁皮石斛以次充好、以假乱真等情况的发生^[4-5]，不少不法商贩为牟取暴利，将石斛属其他种的石斛加工为枫斗，代替铁皮枫斗。其中，钩状石斛、齿瓣石斛、重唇石斛、美花石斛、细茎石斛、短棒石斛等因其原植物及药材与铁皮石斛较为相似，常被加工后冒充铁皮石斛进入市场。石斛类被公认为鉴定最困难的一类中药，铁皮石斛和石斛同属于石斛属。据《中国药典》（2020年版）记录，铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo单独收载于铁皮石斛项下，为铁皮石斛的干燥茎。石斛为兰科金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum Lindl.或流苏石斛Dendrobium fimbriatum Hook.的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎^[6]。

目前，对石斛类药材的鉴定方法主要有理化分析方法和DNA分子鉴定方法。其中，理化分析方法有光谱法、色谱法和质谱法等，但由于普通理化分析方法受石斛化学成分和元素多样且受到环境、种质资源、栽培方式等多种因素的影响，因此特异性不强^[7]。而DNA分子鉴定方法利用基因组中一段公认的标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断^[8]，受外界和生物体发育阶段、器官组织差异的影响较小，相对稳定和便于操作^[7]，因此，目前已成为中药及其混淆品的鉴定的主流技术。《中国药典》（2020版）将DNA条形码作为分子鉴定的指导原则^[9-10]。本实验采用中国植物条形码工作组^[11]推荐的ITS序列进行分子生物学鉴定，以期为政府监管提供依据，指导消费者购买需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：商品名、商品标签标注为“铁皮石斛”的新鲜或干燥茎，及“黄草”、饮片、枫斗等商品。样品采集前，仔细核对样品的包装，对每份样品进行标记拍照，并记录样品信息。共采集标本100份，每个样品随机采集2份，一份为检测样；一份为备份样，用于复检。采购场所包括药店、批发市场、超市等业态和天猫、京东等电商平台，采样信息详见表1。样品的采样和运输应严格按有关规范实施，避免样品破损。

表1 采样信息表

Table 1 Sampling information

试剂：植物基因组DNA提取试剂盒 （E.Z.N.A.® HP Plant DNA Kit，Omega，美国）、ExTaq聚合酶（Takara，250U）。

仪器：梯度PCR仪（美国伯乐BioRad C1000 Touch）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA制备

采用适用于多糖多酚的植物基因组DNA提取试剂盒进行核酸制备，提取方法参见试剂盒说明书。

1.2.2 PCR扩增

根据《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中对铁皮石斛凭证标本和DNA条形码序列共有序列（consensus sequence）的描述^[9]，选择标准序列对位排列进行比对（alignment），找到铁皮石斛特异性位点，设计特异性引物。采用SYBR Green实时荧光PCR方法，对设计的引物进行随机组合扩增，以铁皮石斛和石斛易混淆品样品扩增结果筛选获得特异性良好的4对引物，引物序列见表2。反应体系为PowerUp SYBR Green Master Mix（2×）5 μL，前向引物和后向引物各1 μL，DNA模板1 μL，补齐ddH₂O至10 μL。扩增程序为95℃预变性10 min，进入循环，40次，95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min。以模式标本作为阳性模板，以Nuclease-Free Water作为空白对照。

1.2.3 判定方法

4对引物扩增结果，有至少1对扩增结果出现Ct值≤36时，判定为阳性；4对引物扩增同时出现Ct值≥40时，判定为阴性；有1对引物的扩增结果出现40＞Ct值＞36时，重复扩增，如果至少1对Ct值≤36时，判定为阳性，如果Ct值≥40时，判定为阴性，仍然40＞Ct值＞36时则判断为阴性。

2 结果与分析

2.1 试验结果

根据出现扩增曲线和Ct值，判定阳性结果，并对各样品出现4对引物扩增阳性结果的情况进行统计，见表3。出现阳性结果的样品数共79个，比例为79%。即零售市场上铁皮石斛的正品率为79%，混伪品率为21%。

根据出现扩增曲线和Ct值，判定阴性结果，4对引物扩增均为阴性结果的情况进行统计，出现阴性结果的样品数共21个，比例为21%。

表3 阳性结果统计

Table 3 Statistics of positive results

2.2 结果分析

出现大于等于1个阳性结果即可判定该样品为阳性，即判定结果为铁皮石斛。4个均未出现阳性结果判定为非铁皮石斛，见表4。统计线下采样地区分布阳性结果和阴性结果情况。全市各区抽取样品数共88份，其中，出现阳性结果的铁皮石斛为78.4%，阴性结果的非铁皮石斛为21.6%（图1）。在所有出现结果中，NS区全部为铁皮石斛，其余各区依次为LG区（90.91%）、PS区（88.89%）、BA区（80.00%）、LHX区（70.00%）、LH区（69.57%），FT区铁皮石斛比例最低为46.15%。NS区各业态均为铁皮石斛，相关部门的监管措施得力有效，相较之，FT区的监管尚存在盲区，建议进行针对性的监督监管。在所有阴性结果中，FT区非铁皮石斛比例最高（53.85%），其余各区依次为：LH区（30.43%）、LHX区（30.00%）、BA区（20.00%）、PS区（11.11%）、LG区（9.09%），NS区没有出现非铁皮石斛（图2）。由此判定全市市场上购买到的铁皮石斛判定为铁皮石斛的比例为78.4%，非铁皮石斛的比例为21.6%。

表4 深圳各区铁皮石斛和非铁皮石斛情况

Table 4 Dendrobium candidum and non Dendrobium candidum in various districts of Shenzhen

该比例代表本实验样品鉴定情况，仅供参考。

线上选择了天猫和京东平台的各6家旗舰店，出现阳性结果的铁皮石斛比例均为83.3%，阴性结果非铁皮石斛比例均为16.7%，见表5。2个平台结果一致。线上平台仍出现了混伪品，消费者在采购时无法判定真假混伪，建议商家和平台加强对中药材的监管，信誉度较好的商家可以借助第三方检测平台对产品的真伪进行检测鉴定，以提供给消费者可信赖的结果。

表5 电商平台铁皮石斛和非铁皮石斛情况

Table 5 Dendrobium candidum and non Dendrobium candidum on e-commerce platforms

在各类购样场所中，种植基地全部样品均出现阳性结果，全部为铁皮石斛。其余场所依次为药店（85.71%）、电商平台（83.33%）、批发市场（82.35%）、超市（61.54%），集贸市场铁皮石斛比例最低（42.86%）。未出现阳性结果的非铁皮石斛最高为集贸市场，比例为57.14%，其余场所依次为超市（38.46%）、批发市场（17.65%）、电商平台（16.67%）、药店（14.29%），种植基地没有出现非铁皮石斛。上述情况见表6。种植基地采购时消费者可直接看到种植、包装等实物，商家不易造假，建议对铁皮石斛或中药市场不了解的消费者可以直接到种植基地采购。集贸市场因产品种类和来源地较广，货物流通链条复杂，对于不熟悉相关背景知识的消费者，无法通过经验判定真假混伪，不建议在集贸市场采购（图3）。

表6 各类购样场所铁皮石斛和非铁皮石斛情况

Table 6 Dendrobium candidum and non Dendrobium candidum in various sample purchasing places

图3 各类购样场所鉴定为铁皮石斛情况

Fig.3 Samples identified as Dendrobium candidum in various sample purchasing places

根据各区各类购样场所出现阳性结果的铁皮石斛情况进行统计，LH区的批发市场、种植基地，NS区的药店、批发市场、超市，BA区的药店、超市，LG区的药店、批发市场、超市、种植基地，PS区的批发市场，LHX区的超市，全部为铁皮石斛。出现非铁皮石斛的地区和购样场所为最高的为FT区的超市，75%为非铁皮石斛，其余依次为LH区超市（66.67%）、LHX区集贸市场（66.67%）、FT区批发市场（50.00%）、BA区集贸市场（50.00%）、LG区集贸市场（50.00%）、FT区药店（40.00%）、LHX区药店（25.00%）、BA区批发市场（33.33%）、LH区药店（20.00%）、PS区药店（14.29%）。如表7所示。建议消费者可在LH区的批发市场、种植基地，NS区的药店、批发市场、超市，BA区的药店、超市，LG区的药店、批发市场、超市、种植基地，PS区的批发市场，LHX区的超市放心采购铁皮石斛产品。

表7 深圳各区各类购样场所铁皮石斛和非铁皮石斛情况

Table 7 Dendrobium candidum and non Dendrobium candidum in various sample purchasing places in Shenzhen

3 结论

3.1 深圳市场铁皮石斛质量情况

从本次采集的样品来看，NS区出售的铁皮石斛质量最好，全部为铁皮石斛；FT区非铁皮石斛比例最高；LHX区、BA区、LH区、PS区、LG区均有出售为铁皮石斛但实际为非铁皮石斛的情况。在药店、超市、批发市场、集贸市场和电商平台等各类购样场所中，种植基地出售的铁皮石斛全部鉴定为铁皮石斛，质量最差的为集贸市场，药店、电商平台、批发市场、超市均有出售为铁皮石斛实际为非铁皮石斛的现象。LH区的批发市场、种植基地，NS区的药店、批发市场、超市，BA区的药店、超市，LG区的药店、批发市场、超市、种植基地，PS区的批发市场，LHX区的超市，出售的铁皮石斛质量最好，全部为铁皮石斛。FT区的超市出现非铁皮石斛比例最高。上述结果分析针对所采集样品，可作为各区域和各类市场铁皮石斛真伪情况的参考，但无法反映绝对实际情况。

3.2 铁皮石斛等药食同源鉴别体系现状

目前，我国铁皮石斛乃至药食同源的中药鉴别体系还不完善，标准制定方法未能跟上市场形势，在一定程度上制约了铁皮石斛真假鉴别检测的推广力度，需要持续推进标准的制定，促进行业健康稳定发展。由于铁皮石斛的鉴别需要利用实时荧光PCR仪等大型仪器设备，检测门槛高，消费者大多难以通过常规手段和常识进行准确有效的鉴别，相关部门应扩大对铁皮石斛真伪混淆情况的摸底调查，加强对市场的监督力度。

参考文献

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[3] 宋晓艳, 冯晓, 赵雪梅. 中药铁皮石斛研究概况[J]. 辽宁中医药大学学报, 2015, 17(8): 118-120.

[4] 罗金明. 铁皮石斛产业及市场发展初探[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(4): 472-474.

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[8]钟志敏.石斛DNA条形码鉴定及系统分类研究[D].广州,广州中医药大学, 2018.

[9] 陈士林. 中国药典中药材DNA条形码标准序列[M]. 北京: 科学出版社, 2018: 374-375.

[10] 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典 2020年版四部[M]. 北京: 中国医学科技出版社. 2020: 490-494.

[11]张雯雯. 我国学者提出新种子植物DNA条形码[J]. 农家致富顾问, 2012(2): 16.

第一作者：黄河清（1985—），女，汉族，宁夏银川人，硕士，农艺师，主要从事植物检疫与鉴定，E-mail: 576605750@qq.com

通信作者：高瑞芳（1985—），女，汉族，山西阳泉人，博士，高级农艺师，主要从事植物检疫与鉴定，E-mail: gaoruifang606@sina.com

1. 深圳海关动植物检验检疫技术中心 深圳 518045

2. 深圳海关 深圳 518026

1. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Customs, Shenzhen 518045

2. Shenzhen Customs, Shenzhen 518026

表2 特异性引物序列信息

Table 2 Specific primer sequence information

图1 深圳市场采样鉴定铁皮石斛与非铁皮石斛比例

Fig.1 Ratio of Dendrobium candidum and non Dendrobium candidum of the samples in Shenzhen market

图2 深圳各区鉴定为铁皮石斛的情况

Fig.2 Samples identification of Dendrobium candidum in various districts of Shenzhen

基金项目：宁波市科技计划项目（202002N3114）

第一作者：孙文文（1986—），女，汉族，山东潍坊人，硕士，高级工程师，主要从事食品接触材料法规研究与质量安全，E-mail: yingxue1735@163.com

通信作者：朱晓艳（1978—），女，汉族，浙江兰溪人，博士，研究员，主要从事食品接触材料法规研究与有害物质检测，E-mail: zhuxy@nbyjg.com.cn

1. 常州工业及消费品检验有限公司 常州 213000

2. 常州海关 常州 213000

3. 南京海关危险货物与包装检测中心 常州 213000

4. 宁波检验检疫科学技术研究院 宁波 315012

1. Changzhou Industrial and Consumable Products Inspection Company Limited, Changzhou 213000

2. Changzhou Customs, Changzhou 213000

3. Nanjing Customs Testing Center for Dangerous Goods and Packaging, Changzhou 213000

4. Ningbo Academy of Inspection and Quarantine, Ningbo 315012