蔡佳 李井干 王富海 王欢 刘继坤 曹书培

随着近年来经济全球化高速发展，外来有害生物的传入频率越来越高，世界自然保护同盟研究数据显示，全世界已有近39%的动植物因外来有害生物的传入繁殖而灭绝，给全球动植物资源、农业生产经济造成了巨大损失^[1]。外来杂草是众多外来有害生物中受关注度较小的一类，但其具有传播快、适应能力强、环境阻力小、难防治等特点，严重威胁到我国农业生产、生态环境安全和人民身体健康。菊科是被子植物最大科，我国约有230属2300余种，分别约占全国种子植物属、种的10%和8%，同时也是我国外来入侵种中占比较大、危害较重的种类^[2]。其中，紫茎泽兰、飞机草、毒莴苣、野莴苣、匍匐矢车菊、铺散矢车菊6种菊科杂草更是世界各国一直高度关注的恶性杂草^[3-5]，被我国农业农村部和海关总署列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

海关动植物检验检疫是守护国门生物安全的第一道防线，在进境植物产品的检疫工作中，外来杂草往往以籽实的形态隐藏在粮谷类产品及其包装物中，其籽实微小、形态相似、磨损较大都成为了口岸一线海关关员鉴定的难点，因此研究这6种高危险性的检疫性菊科杂草的形态学特征，形成形态学图谱，为口岸一线关员现场查验时快速鉴定提供理论支撑具有重要意义。

DNA条形码（DNA barcoding）具有不受物种形态学特征影响和发育阶段限制、精准客观、不受外界因素影响等特点，其通用序列的筛选一直是该领域研究的热点问题^[6-10]。ITS、ITS2、matK、rbcL等序列常常被用于对杂草的DNA序列鉴定，选择5种常用序列，对20种口岸进境植物产品检疫工作中常见的菊科杂草进行扩增鉴定，筛选出扩增效率和鉴定效率最高的序列，从而建立针对6种检疫性菊科杂草的DNA条形码鉴别方法，以期为口岸入侵杂草的防控工作提供稳定准确的技术支持，协助海关关员在现场查验过程中对菊科检疫性杂草进行精准分类，提高口岸疫情截获效率，进一步筑牢国门生物安全屏障。

1 材料与方法

1.1 材料

检疫性菊科杂草籽截获不易，目前在国内的标本十分珍贵，杂草籽标本由南京海关动植食中心伏建国、上海海关动植食中心易建平，以及乌鲁木齐海关、黄埔海关、昆明海关、攀枝花海关等单位鼎力支持提供。其中由于野莴苣标本稀少，仅获得由福州海关虞赟提供的DNA序列，最终筛选出形态学特征典型、适合实验所用的5种检疫性菊科杂草籽，如表1所示。同时挑选镇江口岸截获的14种口岸截获常见菊科杂草籽（表2），用于验证最佳DNA条形码的鉴定效果。以上标本均保存于镇江海关。

表1 6种检疫性菊科杂草信息

Table 1 The information of 6 quarantine Compositae weeds

1.2 方法

1.2.1 显微形态学研究

通过利用体视显微镜观察5种检疫性菊科种子的瘦果表面特征，比较瘦果纵切面、冠毛、喙、衣领状环、种脐等形态特征区别，并用智能3D数码显微镜（日本基恩士VHX-6000）采集特征图片，形成形态学特征图谱。

1.2.2 分子生物学研究

根据NCBI数据库和文献[6]中已经报道过的菊科杂草相关序列，选择ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH 5种序列对20种菊科杂草的籽实样品进行扩增，所用引物由北京六合华大基因科技有限公司设计合成，具体序列详见表3。

表3 5种DNA 条形码序列

Table 3 Five DNA barcoding sequences

采用细菌基因组提取试剂盒法提取 DNA，参照试剂盒说明书进行操作。DNA产物置于4℃冰箱中保存，长期保存置于-20℃冰箱。

PCR反应由北京六合华大基因科技有限公司BGI 2×Super PCR Mix（with dye）进行扩增，反应采用30 μL体系：15 μL Super Mix，1 μL DNA 模板，各1 μL上、下游引物(表3），补充ddH₂O 12～30  μL。PCR条件： 96℃、4 min；95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s，10个循环；96℃、20 s，52℃、30 s，72℃、30 s，35个循环；72℃、10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，观察条形性状。使用phred/phrap 软件进行SNP分析并导出分析结果。

通过对利用引物ITS2得到6种菊科杂草籽的DNA序列，以及NCBI数据库中曾报道过的每种近似种相关序列进行分析比较，使用MEGA6构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 杂草籽显微形态特征图谱

利用智能3D数码显微镜（日本基恩士VHX-6000）对挑选出的5种检疫性菊科种子采集特征图片，形成形态学特征图谱如下。

2.2 杂草籽形态特征描述

A1毒莴苣：瘦果，长4～6 mm，宽1.4～2 mm；暗褐色至黑褐色；倒卵状椭圆形；两侧扁平，常向一面弯曲，两面各有数条明显隆起的细线状纵棱，棱脊上有微齿；顶端渐窄至锐尖，并延伸出具细而长、黄白色的喙，约与果体等长或更长，喙脆弱，易折断；基部渐窄，锐尖；果脐位于基端部，近圆形，边缘黄白色^[11-12]。

A2匍匐矢车菊：瘦果，长3～4 mm，宽2～3 mm；倒卵形，顶端较宽而截平，衣领状环不明显，几乎与顶面齐平，中央具1短喙，喙长约0.3 mm，果皮表面乳白色，约具10条不甚清晰的纵肋条，有蜡光泽^[13]。

A3飞机草：瘦果，长3.5～4.1 mm，宽0.4  mm左右；暗褐色；表面具五条细纵脊状突起，棱脊上各附一条冠毛状、不与果体贴生的淡黄色附着物，其上面着生向上的细长柔毛；顶端截平，衣领环黄色不膨大；冠毛宿存，细长芒状，淡黄色，稍长于果体；基部窄，黄褐色；果脐位于端部，近圆形^[12]。

A4铺散矢车菊：瘦果，长2～3.5 mm，宽约1.0 mm，茶褐色或浅黑色，表面平滑，有光泽，具数条黄色纵条纹，条纹间被稀疏的白色短柔毛；顶端较截平，无冠毛或冠毛长度不超过1 mm；衣领状环黄色，整齐突起，中央具残存花柱^[12]。

A5紫茎泽兰：瘦果，长约1.7～1.9 mm，宽和厚均为0.2 mm左右；灰褐色或黑色；长条状五棱形，略弯曲，五条纵棱角外突；表面具细条纹及点状粗糙；两端稍窄小，顶端截平，冠毛脱落，周缘衣领状环膨大外突，黄色；中央具外突的、黄色的宿存花柱；基部收缩；果脐位于基端，黄色，圆柱状^[12]。

A6野莴苣：瘦果，长3～4 mm，宽1～1.25 mm；暗灰褐色；倒卵形或纺锤形；果体边缘窄翼状，两面各有6条明显隆起的细纵棱，棱脊上有微齿突，棱间有一细线沟；顶端渐细成一细弱长喙，顶端膨大成一圆形的羽毛盘，冠毛白色、较粗、长短不一；基部渐窄，端部平截；果脐阔椭圆形，边缘白色，位于果实基部^[4]。

2.3 分子生物学研究

2.3.1 鉴定效率分析

选择ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH 5种常见序列对6种检疫性菊科杂草籽和14种常见菊科杂草籽的对应序列进行扩增测序，重复实验3次，得到5种序列对菊科杂草的测序成功率：ITS2 序列鉴定成功率最高，为100%，psbA-trnH和rbcL序列鉴定成功率分别为66.7%、62%，而matK、ITS的鉴定成功率较低，分别为23.8%和14.3%。

2.3.2 K2P遗传距离

利用MEGA6软件，采用 Maximum composite Likelihood 模型计算种间遗传距离，见表4，6种检疫性菊科杂草ITS2序列的遗传距离最大值为0.351584，是紫茎泽兰与野莴苣的遗传距离；最小值为0.049867，是野莴苣与毒莴苣。从表中可以看出，6种检疫性菊科杂草之间均有遗传距离，存在遗传差异。

2.3.3 构建系统发育树

利用引物ITS2得到6种菊科杂草籽的DNA序列，通过MEGA6构建系统发育树，对6种检疫性菊科杂草籽及每种在BLAST上相似度最高的近似种进行分析比对，构建系统发育树，见图1。

3 结语

菊科是外来有害生物中非常重要的杂草科属，其涵盖了大量检疫性杂草籽，如苍耳属（非中国种）、铺散矢车菊、紫茎泽兰、飞机草、野莴苣等，它们往往会通过交通运输工具、进境动植物产品、人为引进观赏植物等方式传入我国，因其具有极强的生存能力和繁殖能力，给我国的作物经济、农业生产造成巨大的经济损失。此外，部分菊科杂草还会对人畜生命安全造成威胁，如匍匐矢车菊含有的有倍半萜内酯毒素会导致牲畜食用后患上“咀嚼病”；野莴苣被人畜误食后，少量会引起嗜睡焦躁，大量食用则可能会导致心脏麻痹，甚至死亡。因此针对菊科重要检疫性杂草籽建立快速准确的鉴定方法有重要意义。

本研究通过3D数码显微镜对5种检疫性菊科杂草瘦果进行拍摄，直观展现了5种杂草籽喙形状、纵肋数、瘦果表面刺毛形状、长度以及刺间距等形态特征，形成形态学图谱，方便口岸一线海关关员对菊科检疫性杂草精准分类，提高口岸疫情截获效率。

同时，通过对6种检疫性菊科杂草和14种口岸截获常见菊科杂草籽样品的DNA进行提取，研究其ITS、ITS2、rbcL、matK 以及 psbA-trnH序列，发现ITS2序列鉴定成功率最高。对6种检疫性菊科杂草及其23种近似种的ITS2序列进行分析，构建系统发育树。由结果可知，DNA条形码组合ITS2序列可以准确有效地区分6种检疫性菊科杂草及其近似种，本研究可为我国口岸海关关员提供技术参考。

表2 14种常见菊科杂草信息

Table 2 The information of 14 Compositae weeds

表4 6种检疫性菊科杂草ITS2序列的K2P 遗传距离

Table 4 K2P genetic distance of ITS2 sequences of 6 quarantine compositae weeds

图1 基于ITS2序列构建的NJ树

Fig.1 NJ tree based on ITS2 sequence

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