尹伟力 杨柏 阮国栋 张静 孙旭辉 梁君妮 季新成 姜胜男

传染性皮下及造血器官坏死病是虾类重要病毒性病之一，可在对虾中广泛传播，其病原为传染性皮下及造血器官坏死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）^[1]。该病毒是已知最小的对虾病毒，基因组大小为4.1 Kb^[2]。世界动物卫生组织（WOAH）将其收录为需向其申报的甲壳类重要疫病之一；《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》（2020版）将其列为水生生物二类传染病，被农业农村部列入《2022年国家水生动物疫病监测计划》。对IHHNV引起的对虾病害没有有效的治疗方法，只能预防^[3]，因此亟须开发灵敏度高、特异性好的病原体检测技术定期对虾苗种和成虾各生长阶段进行检测，从而有效控制该病的流行。

目前，检测IHHNV的方法主要包括病理学、生物学、免疫学和分子生物学等方法^[4-6]，但是核酸探针斑点杂交、原位杂交和传统PCR等方法所需仪器设备昂贵、过程烦琐，对操作人员技术水平有较高的要求^[7]。环介导等温扩增技术（LAMP）因不依靠变温热循环扩增仪，扩增效率高，反应时间短，可通过浊度分析、核酸染色判定结果等优势成为近几年应用较为广泛的技术。但该技术敏感性较高，容易形成气溶胶，造成样品假阳性影响结果；又由于其对引物要求较高，需设计多对引物，造成引物之间形成二聚体。这些不足限制了LAMP在现场检测的应用^[8-9]。

本研究建立了IHHNV荧光重组酶介导扩增（Recombinase-aid amplification，RAA）检测技术。RAA技术是一种新型的等温核酸扩增技术，利用重组酶和单链DNA结合蛋白（Single-stranded DNA binding，SSB），模板DNA分解为单链，DNA聚合酶对单链进行互补扩增，形成新核酸模板链。该技术在37℃恒温下即可实现核酸的指数扩增，具备简单、节能、快速等优点，适宜IHHNV的快速检测，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源

健康和患病的虾样品均为本单位实验室通过检测确定阳性后保存。

1.1.2 主要试剂

海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit），购自北京天根生化科技有限公司；荧光型核酸扩增试剂（RAA法）购自杭州众测生物科技有限公司；引物由青岛擎科生物科技有限公司合成；探针由上海生工科技有限公司合成；阳性质粒由北京华大基因科技有限公司合成。

1.1.3 主要仪器

离心机-14K（德国，Sigma）；Applied Biosystems 7500 荧光定量 PCR 仪（美国，Thermo）；Genchek II（杭州众测生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 阳性模板的构建

选取对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒的一段保守序列（Genbank NC_002190），由北京华大基因科技有限公司合成质粒。通过核酸浓度测定仪选择波长260 nm，得到合成质粒的浓度。按每1000 bp的 DNA相当于1.52 pmol即10¹⁰ 拷贝数的公式计算，将合成的阳性质粒浓度换算成拷贝数，然后对阳性质粒进行10倍系列稀释，稀释后的浓度分别为10⁴ copies/μL、10³ copies/μL、10² copies/μL、10¹ copies/μL、10⁰ copies/μL。

1.2.2 样品模板的制备

若是仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作样品；若是成虾，则取鳃丝、上皮、肝胰腺或肠，或取附肢作样品。根据海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒操作说明书，对虾组织样品提取DNA，将提取好的DNA分装于1.5 mL离心管中，放置于-20℃冰箱保存，备用。

1.2.3 引物和探针设计

在GenBank中公布的传染性皮下及造血器官坏死病毒基因序列（AF218266）中的保守位置设计特异性扩增引物，见表1。

1.2.4 重组酶介导的实时荧光定量核酸扩增（Real-time RAA）反应条件

按照表2各成分体积数配置反应体系。各成分需混合均匀后，依次加入荧光RAA反应管中，使得管中干粉溶解，可以用枪头反复吸吹混匀，放入离心机中短时离心。打开反应管，加入含有含MgAc的B Buffer反应液2.5 μL。将上述反应管置于Applied Biosystems 7500 荧光定量 PCR 仪中，选择37℃，反应时长为20 min，阴性对照、阳性对照按上述操作进行反应。

表1 引物和探针信息

Table 1 Primer and probe information

表2 反应条件

Table 2 Reaction conditions

1.2.5 灵敏度试验

取稀释后的浓度分别为10⁴ copies/μL、10³ copies/μL、10² copies/μL、10¹ copies/μL、10⁰ copies/μL的阳性质粒，进行灵敏度试验检测。

1.2.6 特异性验证

取经实验室检测为IHHNV阳性的样品，白斑病毒（WSSV）阳性样本、虾肝肠胞虫（EHP）阳性样本、Taura 综合征病毒（TSV）阳性样本和急性肝胰腺坏死病（AHPND）阳性样本进行特异性检测。

1.2.7 实际样本测试

2020—2022年采集491份样品，利用本研究建立的方法，进行RAA检测，同时，采用世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》（2021版）第2.2.4章荧光PCR法进行检测，并比较两种方法的结果。

2 结果和分析

2.1 引物的设计和筛选

对NCBI数据库下载的传染性皮下及造血器官坏死病毒基因序列（Genbank AF218266）进行分析对比，共设计了10条引物和1条探针。以IHHNV核酸作为模板，分别对这些扩增引物对进行条件摸索，最后选定（IHHNV-4-F/ IHHNV-4-R），作为最终选择的引物进行后续实验。

2.2 灵敏度分析

分别对10⁴～10⁰ copies/μL的IHHNV梯度稀释阳性模板进行RAA检测。结果表明，浓度为10¹ copies/μL的阳性对照模板有明显的扩增荧光值，IHHNV的RAA恒温扩增荧光快速检测方法最低检测限为10 copies/μL，见图1。

2.3 特异性分析

用本研究所建立的IHHNV的RAA方法对1份IHHNV阳性样品、1份IHHNV为阴性TSV阳性样品、1份IHHNV为阴性WSSV阳性样品、1份IHHNV为阴性EHP阳性样品和1份IHHNV为阴性AHPND阳性样品进行检测，结果见图2。IHHNV阳性样品有扩增荧光值，阴性对照和其他4份样品均未有扩增荧光值出现，IHHNV RAA恒温扩增荧光快速检测方法对其他对虾病原体无非特异性扩增，对IHHNV检测有良好的特异性。

2.4 实际样本检测结果

采集491份虾类样品分别进行IHHNV荧光RAA检测和IHHNV荧光定量PCR检测，结果显示（图3～4），491份临床样品IHHNV荧光RAA和荧光定量PCR检测结果均为23份样品阳性，468份样品阴性，IHHNV荧光RAA方法与荧光定量PCR结果一致。表明本研究建立的检测方法准确度高，可用于对虾类实际样品的IHHNV检测。

3 讨论

随着我国虾种的引进和虾类产品的贸易加速，IHHNV亦随着种虾和亲虾以及虾产品的贸易引入了我国，造成了很大的经济损失^[10]。中国作为养虾大国，虾的健康和其进出口安全显得十分重要。因此，IHHNV的快速检测技术是一个重要支点，是减少虾养殖损失的基础。

表3 RAA方法和qPCR方法对临床样品检测结果

Table 3 The detection results comparison of clinical samples by RAA and qPCR

RAA技术于2006年首次推出，此后引起了广泛关注。RAA法作为一种新型的恒温扩增技术，已广泛应用于转基因生物、医学病原体和一系列动物疾病的快速检测。例如：Deng等^[11]建立了一种RAA分析方法，在37℃恒温条件下检测转基因水稻中的Cry1Ab/c基因；Liu等^[12]开发的另一种RAA检测方法能够在38℃下30 min内检测到猪细小病毒。

以前的研究表明，RAA反应可以在25～40℃的固定温度下进行，虽然大多数已发表的文章报道，最适温度范围为37～42℃。可以使用不同类型的设备来控制RAA反应的温度，包括培养箱、加热块、化学加热器，甚至体温；在某些情况下，甚至有报道称RAA反应可以发生在环境温度高于30℃的温暖地区^[13]。在本研究中，选择了更为常用的温度进行恒温扩增，结果表明，RAA测定的最适温度为37℃。

与PCR不同，RAA引物的长度应为30～35碱基，尽管有几份报告表明标准PCR引物可用于RAA分析并有效扩增靶点^[14]。RAA分析成功的关键因素是引物设计，然而目前还没有专门的软件来设计这种引物。虽然长度大于45个核苷酸的引物可能导致二级结构和潜在的引物伪影的产生，但较长的引物可以用来提高效率。反之，如果引物太短，则与重组酶的结合率会降低，从而影响扩增速度。然而，较长的引物更可能导致回文序列、连续重复序列和发夹结构，从而使设计更加复杂。以前的报告也建议引物5 ' 末端避免设计长的鸟嘌呤序列（不超过最后5个核苷酸中的3个）。虽然包含胞苷可能是有益的，但同时存在的鸟嘌呤和胞苷在3 '末端往往会提高性能^[15]。此外，推荐的GC含量应在30%～70%之间，任何促进引物-引物相互作用、二级结构或发夹的序列都应该避免，就像常规PCR引物一样^[16]。

本研究新建立的荧光重组酶介导的等温核酸扩增（RAA）方法检测IHHNV，检测时间在20 min内，灵敏度可达到10 copies/μL，特异性良好。RAA反应不需要复杂的仪器，仅需要普通的恒温设备，如水浴锅、保温桶等，甚至靠人体体温如手握、腋下等都可以进行反应^[17]，无需价格高昂的变温扩增仪，反应无需耗费电力，成本低廉，非常适合养殖场、基层实验室、海关检疫现场等，应用前景广阔。

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