陆勤 黄红敏 苏锦坤 涂苏林 吴培丰

Abstract We prepare the quality control serum of treponema pallidum for TPPA and TRUST tests in order to evaluate its stability. The high-concentration treponema pallidum antibody positive serum with clinical TPPA≥1:320 and TRUST≥1:8 is collected and its titer is detected. The negative sera are diluted at the ratio of 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 and 1:32, and placed at 2-8℃ and -20℃ for 18 months. Their TPPA and TRUST titer changes in the dilution series are regularly observed to explore the appropriate dilution concentration for preparing syphilis quality control serum. The self-made quality control serum is stored at different temperatures for 18 months, and the titer is detected every 3 months to observe its stability. The TPPA and TRUST titers of low-concentration positive samples of treponema pallidum antibody with TRUST titers of 1:2 and 1:4 stored at -70℃ for years are retested to observe the changes in stability. Treponema pallidum antibody positive serum is diluted with negative serum, whose preparation concentration is TRUST titer 1:4 and TPPA dilution≥1:160. The stability is good after being stored at 2-8℃ and -20℃ for 18 months. The low concentration serum stock solution with trust titers of 1:2 and 1:4 stored in the laboratory for 9 years is re-tested. We find that the titer is unchanged and can be used as quality control serum directly. This self-made treponema pallidum quality control serum is simple to operate, easy to obtain the raw materials and with sound stability, which can meet the requirements of internal quality control.

Keywords treponema pallidum; quality control serum; stability

人体感染梅毒螺旋体后，机体可产生梅毒螺旋体特异性抗体和非特异性抗体，非特异性抗体是螺旋体破坏组织细胞所释放的类脂样物质，以及螺旋体自身脂类和脂蛋白刺激机体产生的类抗体，又称反应素，主要检测方法有甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）和快速血浆反应素环状卡片试验 （RPR），用于梅毒患者的辅助筛查和疗效监测^[1]。梅毒特异性抗体是针对螺旋体抗原的抗体，经感染后抗体在体内持续存在，终身保留，不因治愈而消失^[2-4]，检测方法包括体明胶颗粒凝集试验（TPPA）、酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）和梅毒螺旋体红细胞凝集试验（TPHA）。出入境口岸梅毒检测使用较多的方法有TRUST和TPPA，为保证结果准确性，检测样本需附带梅毒旋体抗体血清标准物质作为质控品同步测试^[5]。血清标准物质是已知阳性反应的血清制品，可选择在商业机构购买，其优点是可溯源^[6]。但不同检测方法选择的梅毒抗体浓度差异较大，CNAS文件要求质控品浓度为弱阳性^[7]，用于TPPA试验的质控品浓度一般选择80 mIU/mL，TRUST试验的质控品选择浓度为400 mIU/mL，实验室需依据不同检测方法及试剂盒选择购买适合的浓度，实验往往会因为成本控制和缺货而影响质控品使用。自制梅毒质控血清可同时满足TPPA和TRUST试验要求，配制方法简便，稳定性好，节约成本，使用方便。

1 制备材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）试剂由上海荣盛生物技术有限公司提供，梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验（TPPA）试剂由日本富士瑞必欧株式会社提供，梅毒螺旋体标准物质购于北京康彻思坦生物有限公司，所有试剂均在有效期内使用。

1.1.2 血清/浆来源

收集实验室新鲜无脂血、无溶血或黄疸，透明清亮的HBsAg、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体均为阴性的血清/浆混合液作为阴性样本；TPPA≥1:320和TRUST≥1:8血清/浆混合液作为高浓度梅毒螺旋体阳性血清/浆；将实验室2012—2020年保存于-70℃冰箱的TRUST滴度为1:2和1:4阳性血清/浆作为低浓度梅毒螺旋体阳性血清/浆。

1.2 仪器

微量移液器、振荡器（新康XK96-3型）、数显梅毒水平旋转摇床（KANG JIAN KJ-201BD型）。

1.3 梅毒螺旋体质控血清的配制

将收集的阴性样本、梅毒阳性血清/浆于60℃水浴60 min，TPPA和TRUST方法检测阳性混合液滴度，以阴性血清将梅毒螺旋体阳性血清/浆倍比稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的稀释系列，分别放置室温、2～8℃和-20℃，TPPA和TRUST方法检测不同时间段滴度变化。以一年内2种方法检测均为阳性的最高稀释倍数为配制浓度，制备约30 mL满足一年用量，0.22 µm针头注射除菌器滤菌，混匀，分别装到内含橡胶圈的样品保存管，0.5 mL/支，置-20℃或更低温度长期储存。

1.4 梅毒螺旋体抗体检测方法

梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验（TPPA）和甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）检测方法和结果判读详见说明书。

2 稳定性评价结果

2.1 梅毒螺旋体质控血清/浆稀释度选择

将配制好的梅毒螺旋体阳性血清/浆稀释系列，放置不同温度，观察尽量长的时间里，TPPA和TRUST均为阳性情况下梅毒阳性血清的最大稀释度，探索梅毒质控血清配制的合适稀释比例。GB/T 491-2016《梅毒非特异性抗体检测操作指南》中对质控品TRUST滴度要求是1:8，稳定性≥1年。本研究认为自制质控血清在TPPA滴度不小于1:160情况下，TRUST滴度为1:4，一年以上仍能保持良好的凝集效果，由此可获得增加一倍量的阳性稀释血清。

2.2 质控血清/浆稳定性试验

2.2.1 梅毒螺旋体抗体阳性血清稀释系列在不同温度下的稳定性

将滴度为TPPA 1:640，TRUST 1:8的梅毒螺旋体抗体阳性血清/浆稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的稀释系列，在2～8℃和-20℃放置1天、15天、1月、2月、3月、6月、12月和18月，室温放置1天、15天、1月、2月和3月，分别检测TPPA和TRUST。

由表1可知，梅毒阳性血清稀释系列，2～8℃和-20℃放置12个月，室温放置1个月，TPPA和TRUST滴度保持不变。经1:2倍稀释的阳性血清/浆，2～8℃和-20℃放置18个月，室温放置2个月，TPPA和TRUST凝集试验为阳性。

2.2.2 高浓度梅毒螺旋体阳性血清/浆配制的质控品稳定性

以TRUST滴度为1:4且TPPA不小于1:160浓度配制的质控血清放置2～8℃和-20℃保存18个月，分别在0、1、3、6、9、12、18个月时各取出10支做TPPA和TRUST检测，10份样本结果均为阳性，稳定性良好，室温下可保存2个月。

2.2.3 低浓度梅毒螺旋体阳性血清/浆原液稳定性

对实验室保存于-70℃的TRUST滴度为1:2和1:4两个浓度的梅毒螺旋体抗体阳性血清/浆进行TPPA和TRUST留样再测，随机抽取每年两个浓度各10支，不足10支的选当年该浓度所有留样进行试验，结果TPPA和TRUST检测均为阳性，凝集现象明显，见表2。

3 讨论与结语

观察实验结果可知，以TRUST滴度为1:4，且TPPA≥1:160为最终浓度配制梅毒螺旋体质控血清，可满足2～8℃和-20℃温度下存放1年以上，同时TPPA和TRUST阳性检出的最大稀释度（例如：若阳性血清滴度TRUST为1:32，则稀释8倍；TRUST滴度为1:8，则稀释2倍，同时保证TPPA滴度不小于1:160）。由表1可见，同一浓度的稀释血清在不同时间检测TPPA和TRUST滴度水平偶尔出现不稳定，考虑为外界环境条件变化及不同人员稀释手法和判读标准等因素引起^[8-10]。TPPA和TRUST试验均为手工操作，临界值样本肉眼判读结果有时存在±1的不确定性，试验过程需严格按说明书和标准要求，避免因反应板的选择和清洁、反应时间温度的控制、静置环境等原因引起结果不一致。试验中同一稀释水平-20℃保存的血清滴度水平高于2～8℃，可能由于不同保存温度条件引起，GB/T 491-2016中提到，过低温度环境可增加假阳性，提示质控血清从-20℃取出后应放至室温，同时注意检测环境的温度控制。

表2 -70℃保存的TRUST阳性血清原液放置不同时间凝集反应结果

Table 2 Agglutination reaction results of TRUST positive serum stock solution stored at -70℃ for different times

从稳定性看，无论使用高滴度梅毒螺旋体抗体阳性血清稀释配制的质控血清，还是直接使用低浓度梅毒螺旋体抗体阳性血清原液作为质控血清，稳定性均良好。提示临床检测的梅毒螺旋体抗体阳性血清原液经灭活、除菌后低温保存可直接作为质控血清使用。室温下质控血清虽可放置2个月滴度不变，但容易混浊滋生细菌，建议自制质控血清使用时以分装后放-20℃以下冰箱存放，每周取一支放2～8℃随日常试剂使用为宜。

自制梅毒螺旋体质控血清配制方法简单，原料易获得，稳定性良好，可满足实验室室内质控要求。

参考文献

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表1 不同温度下梅毒螺旋体抗体阳性血清稀释系列的稳定性（TPPA 1:640, TRUST 1:8）

Table 1 Stability of dilution series of treponema pallidum antibody positive serum at different temperatures

(TPPA 1:640, TRUST 1:8)