张杰 姚依妮 王开扬 沈飚 章超 何明 郑蔚涛

Abstract Petroleum plays an indispensable role in the economic and social development of China, but there is still a lack of the research on the role of microorganisms in oil pollution. Many species of bacteria of Sphingomonas have attracted increasing attention for their ability to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). In this study, it was proved that Sphingomonas had a strong degrading effect on PAHs of phenanthrene through experiments, and the existence of general alkane-degrading enzymes in Sphingomonas polyphages was search by UniProt database. At the same time, we focused on the basic characteristics of Sphingomonas polyphages and catechol 2,3-dioxygenase, and used the bioinformatics methods to predict and analyze their amino acid physical and chemical properties, homology, protein secondary and tertiary structure, KEGG pathway, etc. The results showed that Sphingomonas yanoikuyae and other bacteria of the genus Sphingomonas may have the ability to degrade both methane and polycarbon alkanes. Due to the high homology with catechol 2,3-dioxygenase gene of Sphingomonas polyphages, Sphingomonas sagittarius may also have the ability to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. The analysis results will be further verified by experiments and prepared for subsequent studies.

Keywords Sphingomonas; bioinformatics; polycyclic aromatichydrocarbons; Sphingomonas polyphages; catechol 2,3-dioxygenase; Sphingomonas yanoikuyae

石油在我国经济社会发展中具有重要作用，但目前我国有关微生物对成品油污染的研究十分欠缺，国内一直存在将微生物污染油品作为正常油品的问题。通常情况下，石油烃被微生物降解的先后顺序为直链烷烃＞支链烷烃＞环烷烃＞多环芳烃＞杂环芳烃^[1]。

好氧烷烃降解菌使用氧气作为烷烃分子活化的反应物，烷烃可以转化为二氧化碳或被同化为多碳化合物，主要反应是通过核糖-磷酸途径和丝氨酸途径^[2]。对于含2个或多个碳原子的正构烷烃，氧化甲基末端生成伯醇通常作为好氧降解的开始，产物随后被进一步氧化为相应的醛，最终转化为脂肪酸。脂肪酸与辅酶A（Coenzyme A，CoA）结合并进一步通过β氧化生成酰基辅酶A^[3-6]。

鞘氨醇单胞菌具有降解复杂有机物、利用各种简单分子以及在极端缺乏营养条件下生存的能力。鞘氨醇单胞菌的外膜中不存在脂多糖，而是含有一种鞘糖脂，其形成的疏水表面更利于这些细菌对芳香化合物等物质的摄取。多种鞘氨醇单胞菌属细菌的代谢范围十分广泛，对链烃的降解速率明显高于芳烃的降解速率，从而导致芳烃降解速率与链烃降解速率之比（PAHs / TPH）升高^[7]，因此鞘氨醇单胞菌对油品中的多数组分都具有较强的降解作用。

本文通过实验研究了鞘氨醇单胞菌对多环芳烃菲的降解作用，并对烷烃降解有关的蛋白酶类进行生物信息学分析，重点研究了多环芳烃对关键酶邻苯二酚-2,3-双加氧酶的降解能力，为进一步深入研究鞘氨醇单胞菌的特征与其石油降解功能提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 降解菌株

菌株购于日本微生物菌种保藏中心（JCM），为多噬香鞘氨醇单胞菌，来自中国厦门，菌株保藏编号：JCM 16711。

1.1.2 菲-无机盐培养基

无机盐培养基（MSM, 1L）：(NH₄) ₂ SO₄ 1000 mg；Na₂HPO₄ 800 mg； KH₂PO₄ 200 mg；MgSO₄·7H₂O 200 mg；FeCl₃·6H₂O 5 mg；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1 mg；CaCl₂·2H₂O 100 mg；去离子水 1000 mL；pH 7.2左右，121℃灭菌20 min。

菲-无机盐液体培养基：用二氯甲烷溶解菲标准品，配置成5 mg/L的菲母液。移取一定的菲母液到已灭菌的无机培养基（MSM）中配置为所需浓度（1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、80.0 mg/L，用于标曲绘制，20 mg/L用于实验）。

1.1.3 溶菌肉汤培养基（LB培养基）

胰蛋白胨10 g；酵母浸膏 5 g；NaCl 10 g；去离子水1 L；将溶液调至pH 7.0～7.2。固体培养基在液体培养基成分基础上外加琼脂 15 g 。

1.1.4 生物信息学预测

本研究采用的烷烃降解酶的数据来自NCBI等数据库，邻苯二酚-2,3-双加氧酶是鞘氨醇单胞菌中对多环芳烃降解的重要酶类之一^[8]。

1.1.5 主要仪器

7000D型三重四级杆气质联用仪（美国安捷伦）；IS-4T型叠加式恒温振荡器（摇床）（美国精骐）； INC821C型低温培养箱（日本山本）。

1.2 实验方法

1.2.1 菲降解作用分析

将目标菌株进行活化和复壮，接种至LB液体培养基中，在摇床中30℃振荡培养；定时观察菌液浊度，12 h后使用分光光度计在波长600 nm的条件下测定吸光度。吸光度为0.6时，吸取1 mL菌液于离心管中，离心后去上清液；加入1 mL培养液重悬洗涤，离心；预先配制好的6个装有菲-MSM培养液的三角瓶，菲的终浓度为20 mg/L，其中，3个设为平行，3个设为空白；吸取等量的菌液添加至3个设为平行的菲-MSM培养液的三角瓶中，3个空白对照组中也加入等量的菲-MSM培养液，30℃下在摇床中避光培养。接种完成后立即取样1次，包括上述3个平行实验组、3个空白对照组各1份。

平行、空白组每隔24 h取样1次。3个平行组各取5 mL菌液，共15 mL混匀，3个空白组各取5 mL菌液共15 mL混匀；然后，取5～10 mL菌液于50 mL 离心管中，加入5 mL乙酸乙酯震荡提取5 min，8000 r/min离心5 min，取上清液于新15 mL离心管，提取操作重复3次，合并上清液；40℃氮气吹至近干，加入0.5 mL正己烷旋涡复溶，上机检测。

配置1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、80.0 mg/L菲正己烷溶液，绘制标准曲线。每隔24 h对空白对照和样品取样，通过标曲测定样品浓度，测算降解率。

1.2.2 菌对石油成分降解作用的分析预测

使用UniProt数据库对鞘氨醇单胞菌属一般烷烃降解酶类进行蛋白功能查阅；使用NCBI-BLAST对邻苯二酚-2,3-双加氧酶编码基因进行同源性分析；使用 Protparam 对邻苯二酚-2,3-双加氧酶的相对分子质量、氨基酸数目、理论等电点等理化性质进行分析；使用PSORTII工具对邻苯二酚-2,3-双加氧酶的亚细胞定位进行预测；使用CDD分析邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白质的保守结构域。运用NPS@服务器上的GOR4程序预测邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白的二级结构；使用SWISS-MODEL数据库对邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白质的三级结构进行分析；使用 KEGG分析邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白基因的代谢通路。

2 结果与分析

2.1 鞘氨醇单胞菌对多环芳烃菲的降解作用

菌株经过打管、培养，在LB固体培养基上呈黄色、圆形，有光泽菌落，为革兰氏阴性，如图1所示，过氧化氢酶活性阳性，氧化酶活性阴性。

图1 显微镜下的鞘氨醇单胞菌

Fig.1 Sphingomonas under the microscope

图2为菲的标准品质谱检测结果，出峰较高的碎片为178、152和89，通过对照，确定为菲，分子量为178。

经过标准曲线测算，24 h后空白组和样品中菲的萃取液浓度分别为141.88 mg/L和50.48 mg/L，降解率为64%；48 h后空白组和样品中菲的浓度分别为157.38 mg/L和35.36 mg/L，降解率为77.5%（见公式1），因而该鞘氨醇单胞菌对菲有比较强的降解作用。

R＝C₀－C₁／C₀ × 100% (1)

式（1）中，R为降解率，C₀为空白组中菲的萃取液浓度，C₁为样品中菲的萃取液浓度。

2.2 直链烷烃降解酶类的检索结果

通过UniProt数据库的检索，发现鞘氨醇单胞菌属的多种细菌具有烷烃降解活性^[9]。以矢野氏鞘氨醇单胞菌为例，据查询结果，推断矢野氏鞘氨醇单胞菌有降解原油中气体甲烷的能力^[10]。同时，矢野氏鞘氨醇单胞菌可以分泌降解甲烷外其他多碳烷烃的主要酶类^[11]，如烷烃羟化酶（alkane hydroxylase），由此推断矢野氏鞘氨醇单胞菌有降解原油中除甲烷外其他多碳长链烷烃的能力^[12]。矢野氏鞘氨醇单胞菌可分泌细胞色素P450单加氧酶^[13]，由此推测，矢野氏鞘氨醇单胞菌可能具有降解碳链长度为5～10的烷烃的能力。

综上所述，矢野氏鞘氨醇单胞菌对甲烷及多个碳原子的正构烷烃都有一定的降解能力。

2.3 鞘氨醇单胞菌对多环芳烃的降解

在多环芳烃及六氯环已烷异构体的降解方面，鞘氨醇单胞菌具有优势^[14]。据报道，多噬香鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas polyaromaticivorans）能降解 2～4环的多环芳烃类，降解菲并有脂肪酶活性^[15]。运用生物信息学方法对其进行分析，结果如下：

（1）基因序列分析。邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因序列如下所示，它的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

>ENA|ACC64604.2| ACC64604.2 Sphingomonas polyaromaticivorans catechol 2,3-dioxygenase

ATGGCATTAACTGGTGTACTTCGCCCTGGCTATGTCCAGTTGCGCGTCCTCGATCTGGATGAGGCAATCCAGCACTATCGTGACCGTATCGGCCTCAACCTGGTGAGCGTCGAGGGCGGCAGGGCTTTCTTCCAGGCCTTCGACGAGTTCGATCGCCACAGCATCATTCTGCGCGAGGCCGATACCGCGGGGCTCGACCGGATGGCATTCAAGGTCGCCAGGGATGCCGATCTCGACCACTTTGCCGAACGGCTGCTCGACATGGGGGTCCACGTCGATATCATTCCGGCGGGCGAGGATCCCGGCGTTGGCCGCAAGATCCGCTTCAATACGCCAACTGCCCACGTGTTCGATCTCTATGCCGAGATGGAGCTGTCCGATACGGGTCCGGCCGTGCGCAATCCGGACGTCTGGATCGCCGAGCCGCGCGGTATGCGCGCGACCAGGTTCGATCATTGCGCGCTCAATGGTGTCGATATTTCGGCGAGCGCGAAGATTTTTGTCGAAGCACTGGATTTTTCGGTCACTGAGGAACTGGTGGACGAAGGGTCCGGCACTCGGCTGGGCATCTTCCTGTCATGCAGCAACAAGGCGCATGACGTGGCGTTTCTGGGCTATCCAGAGGACGGACGGACCCATCACATGTCTTTCAACCTCGAATCTTGGCACGATGTCGGTCATGCGGCGGACATCATCAGCCGCTACGACATCTCGCTCGATATCGGCCCCACCCGCCATGGGATCACACGCGGTCAGACGATCTATTTCTTCGACCCGTCGGGCAACCGCAACGAGACGTTCAGCGGCGGCTATACCTATTATCCCGATAATCCGCGCCGGATGTGGCAGGCCGAGAATGCCGGCAAGGCGATCTTCTATTACGAGAAGGCGCTCAACGACCGCTTCATGACGGTAAACACCTGA

（2）同源性分析。通过NCBI-BLAST进行序列同源比对分析，在核苷酸水平上，该序列与Sphingomonas sp. ZP1 catechol-2,3-oxygenase (C23O) gene（GenBank: HM23 5649.1）的相似性为99.45%，与Rhizobium sp. ZJF08 catechol 2,3-dioxygenase gene（GenBank: DQ534019.1）的相似性为94.91%，与Croceicoccus naphthovorans strain PQ-2 plasmid p1（GenBank: CP011771.1）的相似性为92.32%，与Sphingomonas yanoikuyae B1 catechol 2,3-dioxygenase (xylE) gene的相似性为91.24%。

（3）蛋白的理化性质分析。邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白共包含307个氨基酸，其相对分子质量为34500.60，正电荷氨基酸残基总数为31，负电荷氨基酸残基总数为47，等电点为5.12，偏酸性；不稳定指数为 22.59，是稳定蛋白质；在哺乳动物网织红细胞中，该蛋白质的半衰期为30 h；脂肪指数为79.15，亲水性的平均值（GRAVY）为-0.313，是亲水蛋白质。

（4）蛋白亚细胞定位。使用PSORTⅡ对该蛋白的亚细胞定位，发现该蛋白出现在细胞质中的可能性最大。

（5）保守结构域分析。经分析，邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白氨基酸序列有一个保守结构域，如表1所示。

（6）二级结构预测。通过使用NPS@服务器上的GOR4程序进行预测，得到邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白的二级结构，无规则卷曲（Cc）的比例最高，为45.6%，该蛋白质的二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，Sequence length: 307。

表1 邻苯二酚-2,3-双加氧酶保守结构域分析结果

Table 1 Analysis result of the conserved domains of catechol 2,3-dioxygenase

（7）蛋白质三级结构分析。通过SWISS-MODEL工具对邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白进行预测，得到其蛋白的三级结构。经过分析可知，无规则卷曲在邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白的三级结构中占多数，与二级结构分析结果相同。

（8）KEGG通路分析。通过KEGG工具对邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白基因进行分析，发现其主要参与水杨酸降解后的邻苯二酚降解。图3显示了邻苯二酚降解的相关生物学过程，水杨酸在水杨酸羟化酶的催化作用下产生邻苯二酚，邻苯二酚在邻位或间位裂解酶的作用下生成粘康酸半醛或粘康酸，最终形成二氧化碳和水。

图3 邻苯二酚的KEGG通路

Fig.3 KEGG pathway of catechol

3 结论

实验证明，鞘氨醇单胞菌对多环芳烃菲有较强的降解能力^[16]，且文献表明鞘氨醇单胞菌对链烃的降解速率应该更高。

通过UniProt数据库相关烷烃降解酶的查询及酶功能的确认，矢野氏鞘氨醇单胞菌对甲烷及其他直链烷烃都有一定的降解能力^[17]。GOR4程序预测邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。其中，无规则卷曲占比最高，达45.6%。通常情况下，其作为酶的活性位点和其他蛋白质特异的功能部位，对蛋白质特征的展现与功能的实现都起到了十分重要的作用^[18]。分析发现，邻苯二酚-2,3-双加氧酶蛋白的三维结构以无规则卷曲占多数；邻苯二酚-2,3-双加氧酶有一个保守结构域，即accession number: TIGR03211。在芳香族化合物的代谢过程中，邻苯二酚双加氧酶xyl基因家族起到了关键作用^[19]，邻苯二酚-2,3-双加氧酶xylE蛋白与邻苯二酚-2,3-双加氧酶xylH蛋白等相互作用，共同参与芳香烃的降解过程。由于Sphingomonas yanoikuyae B1 catechol 2,3-dioxygenase (xylE) gene 与多噬香鞘氨醇单胞菌邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因同源性较高，矢野氏鞘氨醇单胞菌可能同时具有多环芳烃降解能力，需要进一步验证。

多环芳烃大量存在于原油中，是重要的环境污染物，具有致癌性。因此，如何在多环芳烃未加工时有效保存油品，在利用鞘氨醇单胞菌对多环芳烃进行降解的同时尽量减少油品中其他成分的降解，利用鞘氨醇单胞菌对溢油等石油污染物进行彻底降解等，仍是后续需要研究的课题。

参考文献

[1] 李洲. 微生物对石油烃的降解机理研究[J]. 云南化工, 2018, 45(9): 179-180.

[2] Raquel L.Lieberman, Amy C. Rosenzweig. Biological methane oxidation: regulation, biochemistry, and active site structure of particulate methane monooxygenase[J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 39(3): 147-164.

[3] R J Watkinson, P Morgan. Physiology of aliphatic[J]. Hydrocarbondegrading microorganisms Biodegradation, 1990, 1: 79-92.

[4] Ashraf W, Mihdhir A, Murrell J C. Bacterial oxidation of propane[J]. FEMS Microbiology Letters, 1994, 122(1-2): 1-6.

[5] Van Hamme J D, Singh A, Ward O P. Recent advances in petroleum microbiology[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67(4): 503-549.

[6] Wentzel A, Ellingsen T E, Kotlar H K, et al. Bacterial metabolism of long-chain n-alkanes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 76(6): 1209-1221.

[7] 周丽沙, 李慧, 张颖, 等. 石油污染土壤鞘氨醇单胞菌遗传多样性16SrDNA-PCR-DGGE分析[J]. 土壤学报, 2011, 48(4): 804-812.

[8] 雷欢. 一株鞘氨醇单胞菌对多环芳烃的降解特性及菲降解途径研究[D]. 厦门: 厦门大学, 2008.

[9] 曹舒祺, 陈梦婕, 侯贤锋, 等.新鞘氨醇单胞菌预处理对木材结构及酶解的影响[J].林产工业, 2022, 59(4): 9-13.

[10] 徐杨. 中国农田土壤中鞘氨醇单胞菌的多样性及丰度与HCHs残留的相关性[D]. 杭州: 浙江大学, 2016.

[11] 王志龙. 鞘氨醇单胞菌SC-1产3-苯氧基苯甲酸降解酶条件优化及酶的固定化研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2013.

[12] 张云龙, 郜春花, 靳东升, 等.矿区复垦土壤中鞘氨醇单胞菌促进秸秆腐解性能分析[J]. 山西农业科学, 2022, 50(1):67-77.

[13] 张云龙. 矿区复垦土壤功能菌株-鞘氨醇单胞菌的筛选及功能分析[D]. 太原: 山西大学, 2021.

[14] 纪婷婷, 高莉, 侯彬, 等.降解多环芳烃的鞘氨醇单胞菌ahdA1c基因的生物信息学分析[J]. 科学技术与工程, 2017, 17(31): 163-169.

[15] 阮博. 蒙脱石介导鞘氨醇单胞菌GY2B降解菲过程的作用机制研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2020.

[16] 张颖, 杨悦, 韦庆慧, 等.鞘氨醇单胞菌的特性及应用研究进展[J]. 化学与生物工程, 2021, 38(3): 6-13.

[17] 王振兴, 陶敏, 方程, 等.一株鞘氨醇单胞菌的分离鉴定及性质表征[J]. 大连工业大学学报, 2019, 38(6): 403-407.

[18] Gibson D T, Parales R E. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2000, 11(3): 236-243.

[19] Jeffrey W H, Cuskey S M, Chapman P J, et al. Characterization of Pseud omonas putida mutants unable tocatabolize benzoate: cloning and characterization of Pseudomonas genes involved in benzoate catabolism and isolation of a chromo somal DNA fragment able to substitute for xylS in activation of the TOL lower-pathway promoter[J]. Journal of Bacteriology, 1992, 174(15): 4986-4996.

图2 菲标准品质谱图

Fig.2 Mass spectrum of phenanthrene standards