钟勇 陈展册 杜智欣 陈应超 黄月虹 盘宝进

生物多样性是地球生命的重要组成部分，也是人类生存和发展的前提和基础。目前，濒危物种的保护是我国生物多样性保护最为迫切的任务之一，也是生物多样性保护的标杆。由于全球人口的高速增长、自然资源的不合理利用和过度开发、世界气候变化，加之生物自身生物学特性的限制，许多野生动植物严重濒危甚至灭绝。在世界范围内，野生动植物贸易导致生物多样性丧失加剧。因为濒危物种本身独具的药用、食用、观赏、收藏等价值，走私分子往往为谋求高额收益铤而走险，使得世界各国走私濒危物种及其制品的违法犯罪活动日益猖獗^[1]。打击濒危物种非法贸易是濒危物种保护和生物多样性保护的重要环节。涉案样本物种鉴定是濒危物种及其制品走私案件涉及的问题，在刑事诉讼的整个活动中，物种鉴定的准确性和速度是最重要的环节之一，这不仅直接关系到犯罪情况的认定，也决定了办案质效^[2]。因此，快速、准确的物种鉴定成为打击濒危物种非法贸易的重要组成部分。本文对形态学鉴定、分子生物学鉴定和理化性质鉴定等现有的濒危物种常用鉴定技术（表1）进行了简介，为濒危物种鉴定工作者提供借鉴和参考。

1 形态学鉴定

形态学鉴定是利用生物固有的特异性外部整体形态或局部组织形态特征进行种类鉴别的技术，是起步最早、最基础的鉴定技术。现代显微技术的发展也使形态学鉴定从宏观特征鉴别向微观特征鉴别发展。组织切片的结构、细胞甚至细胞器形态等微观特征，也逐渐成为物种鉴别的重要依据。在涉案濒危物种鉴定中，有些样本由于加工或其他因素失去外形特征时，便可借助微观特征进行鉴定，如象牙制品形态鉴定^[3]。一般来说，形态鉴定所需工具相对简单，成本较低；无需复杂的前处理环节，鉴定简单省时；很多鉴定工作的开展对场地没有特别要求，甚至在野外作业时即可开展。归因于上述优势，形态学鉴定一直是物种鉴定和濒危物种鉴定的主要技术之一。如《濒危野生动植物物种国际贸易公约》（Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora，CITES）鉴别手册（CITES Wiki Identification Manual）就提供了CITES物种清单中4000多种的形态鉴别数据^[4]。

形态鉴定大多是一种主观的鉴定方式，专家的个人经验很重要。这就导致对于一些珍稀或是未知的物种，很容易出现误判甚至识别不出的情况。同时，形态鉴定通常需要样本保持比较完整的形态特征；群体分化、个体变异、发育阶段等都会影响形态鉴定结论的准确性；而且形态鉴定无法区分野生和人工繁育的样本，还存在杂交种判断困难等鉴定难题，这些因素均制约了形态鉴定的应用。

随着图像识别技术的发展，传统形态学鉴定和人工智能相结合为形态学鉴定在濒危物种鉴定中的应用提供了新的发展方向。这些技术在濒危物种尤其是濒危树种的鉴定中已经有了不少研究和应用报道，例如Mohd等^[5]、Panagiotis等^[6]、Imanurfatiehah等^[7]、王清涛和杨洁^[8]、Heshalini等^[9]、孙永科等^[10]分别开发了基于卷积神经网络（Convolutional Neural Network，CNN，一种常用的计算机深度学习方法，通过模仿动物神经网络行为特征，构建多层的卷积层，自主学习提取图像上的特征进行分类）等技术的木材鉴定图像识别系统。

2 分子生物学鉴定

分子生物学技术的发展使其在濒危物种种类（种群、个体）鉴定中发挥的作用也日益重要。分子生物学鉴定只需非常小的样本，不受鉴定对象形态特征和发育情况的限制。分子生物学鉴定与传统鉴别技术相比有以下两个突出的优点：一是分子生物学鉴定技术相对更加数字化、操作简单规范，结果在实验室之间容易重现和验证，可有效避免结果异议和司法争端；二是在濒危物种非法贸易中，查获物品通常被杀死、分割甚至深加工，往往存在原有形态学特征丢失和理化性质发生改变的情况，从而难以进行鉴别。但由于在高温、高湿甚至高压下DNA也相对稳定，这些死亡组织、分割残体和深加工品仍能提供可供检测的DNA片段并开展鉴定。这些优点使得分子生物学鉴定可以在物种鉴定，尤其是在打击濒危物种非法贸易的司法鉴定中能够发挥非常关键的作用。目前，DNA条形码和核DNA标记普遍采用分子生物学鉴定技术。

2.1 DNA条形码

DNA条形码鉴定技术，是通过将生物体内能够代表该物种的、标准的、具有足够变异的、易于扩增且相对较短的DNA片段，与数据库中参考序列进行比对，以实现物种鉴别的手段^[11]。由于线粒体DNA（mtDNA）具有无组织特异性（不受取样部位限制）、拷贝数多（较核DNA易扩增）、母系遗传（所有子代保持母本遗传信息，不受杂交等影响）、进化速度快（可以检测到分化相对较短时间内的种群之间的差异）、以碱基转换和颠换为主（插入、缺失及重排较少）等优势，因此DNA条形码通常以mtDNA的全长或部分序列作为参考序列，其中COⅠ、CytB、D-Loop区、12S rRNA、16S rRNA和ND2等是常用的DNA条形码序列^[12]。植物中mtDNA的ITS、ITS2和叶绿体DNA的matK、psbA-trnH、rbcL等片段也是常用靶标^[13]。此外，测序技术的进步，尤其是高通量测序技术的发展，使得混合样本中濒危物种的鉴定成为可能。DNA宏条形码技术正是在此基础上发展起来的物种鉴定技术。该技术包括单基因宏条形码^[14-16]和多位点宏条形码^[17-18]技术。

虽然目前物种鉴定中DNA条形码是一种公认的标准的鉴定方法，公共数据库中有大量的条形码参考序列，但是对于部分稀有物种，数据库中仍然缺乏其参考序列，也导致部分物种无法鉴定的情况产生。

2.2 核DNA标记

核DNA是生物最主要的遗传信息载体，其序列特异性是进行物种鉴定的重要依据^[12]。目前基于核DNA标记的技术在遗传学分析中已有大量的应用，主要有单核苷酸多态性（SNP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、随机扩增DNA多态性（RAPD）、微卫星DNA、相关序列扩增多态性（SRAP）等。单核苷酸多态性标记、微卫星DNA是研究和应用较广泛的核DNA标记技术。

单核苷酸多态性检测是杂交检测的主要标准，在多样性研究（物种鉴定、相关性分析和种群分析等）中也有广泛使用。在大规模测序方法出现后，单核苷酸多态性鉴定能同时分析数百个样本，且该技术在实验室间具有良好的重现性，因此应用越来越广泛。如我国有学者利用单核苷酸多态性标记分析了我国易危物种野生凹叶木兰的遗传多样性^[19]。在常规鉴定分析中应用时，必须先确定具有物种区分能力（私有“多态性”）的SNP，以便随后开发相应检测方法。单核苷酸多态性是由单个碱基变异所引起的 DNA序列多态性，而微卫星DNA则是由短串联重复序列组成（通常2～6个碱基）。微卫星DNA是目前遗传分析中最常用的分子标记^[20]，具有种类多、分布广、低重组率、高杂合度、高多态性、检测速度快等特点。其高变异性（每个基因座的等位基因数）使得微卫星DNA成为遗传多样性研究中非常实用的工具。微卫星DNA广泛应用于不同多样性水平的遗传分化标记（相关性、种群分析、物种鉴定、杂交检测），在野生动植物保护、种群生物学、系统发育等研究领域也有广泛应用^[12]。Wasser等^[21]利用微卫星分析缉获象牙的基因型，揭示了国际象牙贩卖的网络及规模，这对打击濒危物种非法贸易是一个重要的工具和参考。

但微卫星技术在不同实验室之间的结果重现性不稳定，因此需进行实验室间比对；等位基因丢失、无效等位基因或错误的等位基因数量估计均会导致鉴别错误；同时，采用这种方法的实验室都应具有已知基因型的参考样本。

此外，核DNA通常较mtDNA更难扩增。长期放置或加工处理后的样本，会因其DNA损伤或降解出现核DNA标记扩增失败的情况，从而导致无法鉴定；而很多时候，mtDNA仍可以扩增，开展鉴定工作。

3 理化性质鉴定

随着现代物理和化学分析技术的进步，理化性质鉴定已由以前的色泽、气味等简单的判别指标发展为依据生物体内化学物质的数量、组成、比例，和这些物质的理化性质等特异性来进行种类鉴定。同时利用这些性质的地域特异性，开展地理溯源。

3.1 物理性质

密度、体积干缩系数、物理强度等传统物理性质，常用来作为物种的物理鉴定依据^[22-23]。光谱（红外IR、近红外NIR、紫外UV等）、全卷积神经网络（Fully Convolutional Neworks，FCN，一种常用的计算机深度学习方法，从图像级别的分类进一步延伸到像素级别的分类）、焦点物种识别器组合（AFSR）、核磁共振波谱（NMR）等^[12]现代物理分析技术，利用样本微观结构或特异性成分的特征谱等对生物组织及生物制品进行种类鉴定。这些技术为无损鉴定技术提供了基础^[24]。而可见-近红外光谱分析与化学分析相结合，实现了对物种的快速无损鉴别及其地理来源追溯^[25]。

3.2 化学性质

化学性质鉴定主要是利用高灵敏的现代化学检测仪器检测各物种的化学成分特异性，通过提取和分析化学成分及其组成比例进行鉴定。质谱（电感耦合等离子体质谱ICP-MS、同位素比率质谱IRMS、快速蒸发电离质谱REIMS、电喷雾电离质谱ESIMS等）^[12,26-27]、色谱（薄层色谱TCL、高效液相色谱HPLC、气相色谱GC等）^[12,28]、色谱-质谱联用（气-质联用GC-MS、液-质联用HPLC-MS等）^[28]等现代化学分析技术在濒危物种鉴定及农产品溯源中已有大量研究和应用。化学鉴定中，稳定同位素组成分析是目前使用最广泛，也是最成熟的技术，是目前公认的标准方法，被广泛用于濒危物种、食品、农产品等的溯源中^[29-32]。生长环境直接影响植物稳定同位素组成，植物及其产品中的C、H、O、N、S、Sr、Pb等几种元素的同位素常用于其产地溯源^[32]。在动物中，C同位素与动物饲料密切相关，可以用于区分饲养方式； H、O同位素与当地降水、地下水及地理纬度等有关，一般受饮用水影响；N、S同位素一般与土壤和气候等环境有关；Sr同位素一般受地质条件直接影响^[33]。IRMS不仅被用来追溯毒品的来源^[34]，还被用来开展象牙原产地追溯^[24]。此外，矿物元素^[33]、脂肪酸^[35]、有机成分^[36]、代谢物^[37]等在鉴定及产地溯源中都有不少研究和应用报道。

理化鉴定技术具有快速、高效、可靠的优势，但对样本保存要求较高。存放期限、环境条件和加工过程等，都会影响甚至改变样本的理化性质，进而影响鉴定结果。样本存放时间过长或保存不当会导致理化性质的改变，从而极大地影响理化鉴定结果的准确性，甚至会出现鉴定错误或无法鉴定的情况。同时，理化鉴定需要具有较高专业技术的鉴定人员进行仪器操作和数据分析，这也成为限制其普及应用的重要因素^[12]。

4 小结

每年珍稀野生生物非法贸易相关数额可高达80～100亿美元，已经成为国际犯罪集团谋求巨额收益的三大全球性违法活动（珍稀野生生物非法贸易、毒品贩卖、军火走私）之一^[38]。我国作为CITES的缔约国，历来都高度重视并严厉打击濒危物种及其制品非法交易。中国海关是我国打击濒危物种及其制品走私犯罪的主要行政执法部门。近些年来，多次会同相关国内职能部门和国际机构联合实施了大量的国内、国际专项行动；“零容忍”的打击力度和成效也获得了CITES秘书处、世界海关组织等国际组织的高度肯定和赞誉^[1]。野生动植物贸易监管一直十分困难，并且随着电子商务、跨境电商的兴起，监管模式面临着诸多新的挑战，同样也对鉴定技术提出了新的要求。为此，海关总署牵头成立了进出境濒危物种鉴定实验室联盟。联盟将在濒危物种鉴定技术研究及其标准化中发挥技术优势，为濒危物种保护和打击濒危物种非法贸易进一步贡献中国海关的力量。

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