石嵩 吕雨莎 马师良 张惠媛

Abstract To develop a bacteria-containing mask sample for the national proficiency testing project for the detection of pathogenic bacteria in the field of disposable sanitary products, the bacteria-containing mask samples were prepared by artificial contamination and freeze-drying. Positive samples contain target bacteria, interfering bacteria and background bacteria, while negative samples only contain interfering bacteria and background bacteria. Randomly select 20 bottles of negative samples and 10 bottles of positive samples for homogeneity testing; store the samples at -20^oC and 4^oC for 120 days, and store them at 25^oC, 36^oC and 42^oC for 20-60 days to monitor their stability. According to GB 15979-2002 Appendix B5 Pseudomonas aeruginosa detection method, the test results should be consistent with the assigned value. Two samples will be distributed, and the laboratory will receive at least 1 positive sample, and the rest will be distributed randomly. In order to prevent data collusion, the samples were randomly numbered and the result reporting time was shortened. Results showed that the samples could meet the requirements of proficiency testing in terms of homogeneity, storage stability and transportation stability. The results of 290 laboratories that passed the assessment were satisfactory, accounting for 98.3%; the results of 5 laboratories were dissatisfactory, accounting for 1.7%. The proficiency testing samples for the detection of Pseudomonas aeruginosa in masks can meet the requirements of proficiency testing. This proficiency testing can truly reflect the testing environment and testing level of the participating organizations, and improve the product quality and safety of disposable anti-epidemic materials.

Keywords Pseudomonas aeruginosa; national proficiency testing; masks; disposable hygiene products

当前，口罩作为最重要的防疫物资已成为人们日常生活的必需品，其质量安全将直接影响疫情的防控效果。口罩属于一次性卫生用品范畴，其微生物指标应符合GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》^[1]中不得检出“化脓性致病菌”的要求，并要求按照标准中附录B的相关条款进行检测。铜绿假单胞菌（原称绿脓杆菌，Pseudomonas aeruginosa）就是“化脓性致病菌”中最常见的条件致病菌^[2]，受其污染的用品可引起皮肤、黏膜的化脓和感染。因此，对其致病菌等卫生质量指标进行检测具有非常重要的意义。利用此标准，在日常监督过程中发现各类一次性使用卫生用品的卫生质量合格率在95%～98%^[3-4]，而部分地区的皮肤黏膜卫生用品的合格率仅为88.2%^[5]，且主要问题仍然集中在微生物指标检测不合格^[6]。可见口罩等卫生用品依然存在致病菌污染的风险，对口罩进行化脓性致病菌检测是必要的。检测机构的检测能力是保障结果准确性的重要因素，因此有必要对检测机构使用有效的质控手段，对其检测能力进行评估。

能力验证（proficiency testing）即利用实验室间比对，按照预先规定的准则评定参加者的能力^[7-8]。ISO/IEC 17025要求认可实验室证明其检验质量和能力^[9]。因此，一些实验室为了满足认证机构的要求，才去参加能力验证^[10]。而能力验证的目的是让实验室及时采取纠正措施，提高检测水平^[11]。目前国内外微生物领域能力验证主要集中在食品、饲料和化妆品等领域，而针对一次性使用卫生用品和相关实物样品的能力验证活动尚无人开展。

本次能力验证是由国家市场监督管理总局组织的2020年国家级检验检测机构能力验证计划之一。采用真实的口罩样品对参试实验室进行考核。这是国内一次性使用卫生用品领域首次组织的全国范围能力验证活动，不仅有效地评估了相关检验检测机构的技术能力，还提高了防疫防护用品的检测质量，进而保障防疫物资的产品质量安全。

1 材料与方法

1.1 菌株

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa CMCC 10104）、蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides ATCC 10206）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris ATCC 49132）、头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis subsp. capitis ATCC 35661）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida ATCC 49128）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli ATCC 25922）均购于美国菌种保藏中心和中国医学细菌保藏管理中心。

1.2 仪器与试剂

PiloFD8冷冻干燥机（金西盟）；生物安全柜Ⅱ级A2型（LABCONCO）；ICP600恒温培养箱（Memmert）；VITEK compact 2微生物鉴定系统（梅里埃）。

SCDLP肉汤、十六烷三甲基溴化铵琼脂（以下简称“十六烷”）、氯化钠（北京陆桥）；脱脂乳粉（BD）；蔗糖（国药）。

1.3 样品设计与制备

1.3.1 口罩能力验证样品设计

样品性状：西林瓶内装有一枚经过裁切的口罩样品，其作为一个独立的检测单元，不能拆分。该口罩可直接用于检测，无需再次称量。

样品设置：本次能力验证样品为实物口罩，添加4种可以溯源的标准菌株，形成多种组合，制成难易程度不同的2组阳性样品，Ⅰ组样品中含有目标菌及背景菌，Ⅱ组样品在Ⅰ组的基础上添加了同属干扰菌，阴性样品共设计1组样品，不含有目标菌。见表1。

表1 样品中添加的标准菌株

Table 1 Type strains added to samples

1.3.2 能力验证样品制备

样品准备：从国内同一口罩生产厂家，购买相同批次的医用无菌口罩。将口罩中的金属垫片剔除，裁剪成大小约为5 cm×6 cm的矩形样品。经灭菌、烘干后备用。

保护剂准备：取脱脂乳粉5 g及蔗糖5 g在100 mL无菌水中煮沸溶解后，将其高压灭菌后备用。

菌株制备：将表1中所有菌株分别活化。使用生化鉴定仪进行鉴定，同时确保菌株在相关培养基上的菌落特征典型，无生化变异和菌落变异现象。将所有菌株的菌悬液调节至0.5个麦氏浊度值，并逐级稀释后备用，分组后与冻干保护剂混匀备用。

冷冻干燥：准确吸取含有保护剂的菌悬液，添加至无菌口罩中，随后将其置于无菌西林瓶内进行48 h真空冷冻干燥。各组样品分批次冻干，冻干后的样品立即粘贴样品标识。

1.4 样品的检验

根据GB 15979-2002附录B检验方法制定此次能力验证参试指导书，并用于后续的样品均匀性与稳定性检验。

1.4.1 均匀性检验

依据CNAS-CL03-A001-2019《能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明》^[12]，在两种阳性（Ⅰ、Ⅱ）组样品中分别随机抽取10份样品；阴性样品（Ⅲ）组中随机抽取20份样品。按照参试指导书中样品测试要求，使用GB 15979-2002附录B5 铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）检测方法进行检测，在重复条件下，即在同一实验室中由相同人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间进行检测，即阳性样品为应检出铜绿假单胞菌（绿脓杆菌），阴性样品则不应检出铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）。

1.4.2 稳定性检验

微生物能力验证样品是以口罩为载体的实物样品，其稳定性主要受保存条件、运输条件等因素影响。

（1）贮存稳定性：样品贮存温度为4^oC，试验持续3个月，每月测定一次，贮存稳定性检测周期应持续到所有参试实验室结果反馈后结束。该试验是评估样品在贮存及考核过程中的稳定性。

（2）模拟运输稳定性：该试验主要模拟样品在运输过程中可能出现的高温情况，用于评估样品在运输过程中的稳定性。选取阴性及2组阳性各45份样品，并平均分成3组，每组15份，分别贮存于25^oC、36^oC和42^oC的条件下。分别在3 d、5 d、7 d、10 d、15 d时进行检测，每次检测3份样品。以上检测过程、结果判定及实验室环境等均与均匀性测试要求相同。

1.5 能力验证实施方案

1.5.1 考核样品组成

考核样品共2份，阴、阳性样品随机发放，但保证每个参试实验室至少收到一份指定值为阳性的样品，所有样品均需按照参试指导书以及检测标准要求进行检测，反馈结果。

1.5.2 样品发放

样品采用4层包装，第一层为无菌西林瓶，内盛待检口罩；第二层为塑料泡沫垫；第三层为塑料泡沫箱；第四层为快递专用硬质牛皮纸盒，以透明胶带黏贴并封口。包装后当日寄出。

1.5.3 测定方法

参试实验室必须使用GB 15979-2002附录B5进行检测。

1.5.4 防止串通措施

样品发放采用随机抽取的方式，阴阳性样本随机编号，编号之间无规律。缩短能力验证结果上报时间，并要求实验室提交分离平板照片，防止实验室间伪造或串通结果。

1.5.5 指定值来源与结果评价原则

指定值来源：本次能力验证活动中，在样品制备时使用可溯源的标准菌株作为指定值来源。并通过随机抽取的方式对样品指定值进行检测。

评价准则：实验室应对每份样品给出检测结果，使用“阴性”“阳性”或“检出”“未检出”上报检测结果。实验室测试结果与已知指定值进行比较，所有样品检测结果与指定值一致时为满意结果；任意一份样品，定性错误判定为不满意结果。

技术分析：本次能力验证计划中，参试实验室不仅反馈了原始记录，还提交了分离平板照片作为结果考察资料。通过这些资料，对共性问题和不满意结果进行了汇总和原因分析。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

考核所用菌株制备前经过VITEK compact 2鉴定后，未发现菌株变异现象，鉴定结果准确，可用于能力验证样品的制备。见表2。

2.2 样品的均匀性检验结果

样品制备完成后，立即抽取每种阳性样本各10瓶，阴性样本20瓶，按照“参试指导书”要求和GB 15979-2002附录B5的方法进行检测，所有样品的检测值与预期指定值均一致，表明本次能力验证样品是均匀的，指定值可用于能力验证结果的评价。见表3。

表3 样品均匀性测定结论

Table 3 Results of sample homogeneity determination

2.3 样品的稳定性检验结果

2.3.1 样品的贮存稳定性评价

样品分别在-20^oC及4^oC下贮存120 d，于30 d、60 d、90 d及120 d分别随机抽取阴性及阳性样品各3瓶进行检测。结果显示，阳性样品在-20^oC和4^oC条件下贮存均能检出目标菌。表明该样品在实施周期内稳定性良好，满足本次能力验证要求。

2.3.2 样品的运输稳定性评价

在25^oC条件下60 d，36^oC条件下40 d以及在42^oC条件下15 d时，阳性样品均能够检出目标菌（具体见表1）。根据以上实验结果，本次能力验证样品发放时应选择航空运输的快递方式，并在泡沫箱中加放冰袋，可保证样品在短时间内保持低于42^oC的温度下送达实验室。本次能力验证平均运输时长为3个自然日，最长在5个自然日内均到达参试单位，并要求实验室在收到样品后10个自然日内完成检测并上报结果，见表4。

表4 样品稳定性测定结论

Table 4 Results of sample stability determination

注: “+”为检出;“-”为未检出

稳定性试验结果表明，样品在贮存和运输过程中稳定性良好。所有样品在能力验证实施周期内其指定值不会发生变化。

2.4 考核结果

2.4.1 结果统计

本次能力验证共有295家实验室参加。按照1.5.5款的评价原则，共有290家实验室获得满意结果，满意率为98.3%；5家实验室结果为不满意，不满意率为1.7%。

从样品类型统计共回收590个有效结果。其中583个结果满意，满意率为98.8%；7个结果不满意，不满意率为1.2%。从样品组别统计，Ⅰ组（阳性）样品共发送249份样品，共有246个满意结果，满意率为98.8%，3个不满意结果（假阴性），不满意率为1.2%；Ⅱ组（阳性）样品共发送253份样品，共有249个满意结果，满意率为98.4%，4个结果不满意（假阴性），不满意率为1.6%；Ⅲ组（阴性）样品共发送88份样品，共有88个满意结果，满意率为100%，详见表5。

2.4.2 参试实验室类型及地区统计

参加考核的实验室分布于全国31个省（市）、自治区，本次能力验证参试单位涉及市场监督管理局、海关、疾控中心、医疗器械检测、第三方检测机构及生产企业等。

2.4.3 培养基使用情况统计

通过对原始记录进行分析可见，参加本次能力验证的参试机构中，有187家使用了单一培养基、99家使用了两种培养基、9家使用了三种培养基。使用两种及以上培养基的机构数占比较低，仅为36.6%。

表5 参试实验室能力验证结果

Table 5 Proficiency testing results of the participating laboratories

在使用单一培养基的187家参试机构中，使用十六烷的有180家，占96.3%。在使用两种培养基的99家参试机构中，有73家机构使用十六烷和CN平板的组合，占比73.7%，其余26家机构使用了十六烷加乙酰胺以及十六烷加其他培养基的组合，在使用三种培养的9家参试机构中，有2家使用了十六烷加CN平板加乙酰胺琼脂平板的组合，占比22.2%，其他7家机构使用了十六烷加CN加其他培养基、乙酰胺加CN加其他培养基以及十六烷加两种其他培养基的组合。详见表6。

2.4.4 鉴定方式统计

GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录B中绿脓杆菌生化鉴定方式为革兰氏染色镜检、氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验和42^oC生长试验等6种鉴定试验。

295家参试实验室中83家实验室完全参照国标方法进行鉴定，占比为28.1%。212家实验室未完全遵循国标方法进行鉴定，占比为71.9%。有88家实验室使用了鉴定仪作为补充，占比为29.8%；其中有10家实验室完全参照国标方法且使用鉴定仪；58家实验室使用鉴定仪，但鉴定方法少于国标要求的方法；20家实验室仅用了鉴定仪，详见表7。

试验过程中的质控菌株使用情况，有179家实验室在试验过程中仅使用了阳性或阴性中的一种标准菌株进行质控，35家实验室同时带有阴、阳性菌株质控，19家实验室未使用任何质控菌株。获得假阴性结果者均是未使用阳性对照菌株的实验室，获得假阴性结果的5家实验室中有2家使用了阴性对照菌株、3家实验室未使用任何对照菌株。详见表8。

3 讨论

本研究采用以口罩为载体的实物样品方式，完全复现天然样品的全流程检测，对参试实验室进行考核。不仅考察了实验室的检测水平，还评价其环境设施是否满足标准要求，进而实现对实验室技术水平和检测能力的全面评价。在国内填补了该领域能力验证活动的空白。由于微生物检测样品的特殊性，其能力验证样品通常以冻干粉或菌球的样品形式存在^[13-14]。这类样品的制备方式较为成熟，而且样品稳定性较好^[15]，而对于实物类型的微生物能力验证样品的研制对制备工艺提出了更高的要求，不仅要保证添加到基质中的微生物分布均匀，而且需要具有良好的存活稳定性。

本研究制备的能力验证样品，通过均匀性、贮藏稳定性及运输稳定性分析发现，该样品均匀、稳定，实际运输中不受环境等条件的限制，可用于全国各地区的能力验证使用。

为了准确查找部分实验室检验结果不满意的原因，对所有实验室提供的原始记录进行了分析，发现以下问题：

第一，在获得不满意结果评价的实验室中绝大部分实验室平板划线分离水平较差，纯菌分离是微生物学实验中最常用的技术^[16]。划线水平的高低将直接影响目标菌（阳性菌）的分离率，建议实验室加强平板划线分离的培训，从而为目标菌的成功分离奠定基础。

第二，有些实验室在进行检测时并未设置质控菌株对照或空白对照，致使不能明确判断是否存在环境污染或交叉污染等情况。同时，带有阴、阳性对照的实验室的满意率为100%，这表明检测过程中设立质量控制是实验室检测质量的保证^[17-18]。

第三，个别实验室的阳性样品平板上无任何菌落生长，且该实验室的阳性对照平板也无任何菌落生长，可见该实验室在培养基使用前未进行有效的技术性验收，因此建议实验室在检测开始前，应对采购的培养基进行有效的技术性验收，保证检测结果的准确性。

第四，大部分实验室在鉴定时未完全按照标准要求的全部步骤进行鉴定，这些实验室的评价满意率低于完全遵照标准要求或增加辅助鉴定方法进行鉴定的实验室，建议实验室应至少完全遵照标准的要求进行鉴定，而不能低于标准要求。

通过本研究制备的能力验证样品，考察了相关实验室的检测能力，真实反应出实验室检测环境和设施条件及检测技术水平。一方面可以有效地评估一次性卫生用品相关检验检测机构的技术能力；另一方面可以提高防疫防护用品的检测质量，进而提升口罩等一次性使用防疫物资的产品质量安全。

参考文献

[1] GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2002.

[2]付莹, 李文化, 黄薇. 25例绿脓杆菌感染原因分析[J]. 华北煤炭医学院学报, 2011, 13(6): 802.

[3] 尹俐, 黄世美, 雷鸣, 等. 247份一次性卫生用品微生物检测结果分析[J].医学动物防制, 2010, 26(1): 69-70.

[4] 胡慧玲, 洪照宽, 陈莉. 342份一次性卫生用品微生物指标监测分析及对策[J].中外医疗, 2009, 28(33): 106+108.

[5] 王书杰. 北京市一次性使用卫生用品抽检结果分析[J].中国消毒学杂志, 2006(4): 338-339.

[6] 李云, 李丽婕, 宋红梅, 等.石家庄市一次性卫生用品微生物污染检测[J].中国消毒学杂志, 2008(5):582.

[7] CNAS-RL02 能力验证规则[S]. 北京: 中国合格评定国家认可委员会, 2018.

[8] GB/T 27043-2012/ISO/IEC17043合格评定能力验证的通用要求[S]. 北京: 北京标准出版社, 2010.

[9] ISO/IEC 17025 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories [S]. ABNT, 2005.

[10] 毛燕, 闫林.实验室参加能力验证活动的意义分析[J]. 食品安全质量检测学报, 2014, 5(9): 2958-2961.

[11] 雅丹, 项新华, 毛歆, 等. 2013-2014年食药系统食品检测能力验证活动浅析[C]. 中国药学会第二届药物检测质量管理学术研讨会, 2015: 4.

[12] CNAS-CL03-A001能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明[S]. 北京: 中国标准出版社, 2019.

[13] 孙晓霞, 胡连霞, 王建昌,等. 单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品的制备与验证[J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(2): 556-561.

[14] 王娜, 钱和. 阪崎肠杆菌能力验证样品均匀性和稳定性的研究[J]. 中国微生态学杂志, 2010, 22(7): 606-608.

[15] 刘芳, 杨平, 李传礼. 菌落总数能力验证样品均匀性和稳定性[J]. 食品安全质量检测学报, 2015, 6(11): 4652-4658.

[16] 周德庆, 张文治, 强义国.平板划线法分离微生物纯种的一个经验[J]. 生物学教学, 1981(1): 28-29.

[17] 范蕊, 阿依努尔·阿娜比亚, 曹雪琴, 等.食品微生物检验及实验室质量控制[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(9): 3824-3829.

[18] 付敏, 陶文靖, 赵婷婷. 食品微生物实验室质量控制的研究与实践[J]. 食品安全导刊, 2020(16): 41-43.