黎财慧 姚丽锋 张晴阳 丁琦 冯家望

沙门氏菌（Salmonella）是人畜共患病的主要病原菌之一，在自然界中普遍分布。该菌能引起人类及动物的食物中毒及各种疾病，如伤寒、肠胃炎、严重时会引发败血症等^[1-4]。据相关报道，沙门氏菌已成为导致中国食源性疾病的第二大病原菌^[5]；在美国，每年因沙门氏菌感染出现的病例约120多万例^[6]。人类主要通过被沙门氏菌污染的肉、蛋、奶等食品及其相关产品感染沙门氏菌^[6-8]，动物主要是通过被沙门氏菌污染的饲料被感染，因此国内外标准中普遍规定在食品及饲料中不得检出沙门氏菌。所以，在食源性疾病发生时，病原菌活菌的精准快速检测技术就显得十分必要^[9-10]。

传统的沙门氏菌检测方法，通常需要3～5 d，并且存在产生假阳性的风险。目前用于该菌的快速检测方法主要有普通PCR方法和实时荧光PCR方法，但这两种方法都存在无法区别检样中的活/死菌的问题。对活菌DNA进行扩增的同时，也对死菌DNA进行扩增，容易产生假阳性结果^[11-13]。叠氮溴化乙锭（Ethidium monoazide bromide，EMA）是一种能够经受损细胞膜进入死菌细胞中，与死菌的DNA进行反应并结合，使死菌DNA无法被PCR扩增而对活菌无影响的一种荧光染料。近年来，叠氮溴化乙锭结合荧光PCR（Ethidium monoazide bromide real-time PCR，EMA-RT-PCR）在副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157菌等致病菌上已建立了快速检测技术^[14-18]。

本研究以沙门氏菌为研究对象，在前期研究基础上，进一步优化沙门氏菌活菌检测的EMA-RT-PCR方法，提高其准确性与灵敏度，以建立沙门氏菌活菌RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验所用菌株肠炎沙门氏菌（CCTCC AB 94018）、伤寒沙门氏菌[CMCC(B) 50071]、甲型副伤寒沙门氏菌[CMCC(B) 50093]、乙型副伤寒沙门氏菌[CMCC(B) 50094]、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 700730）、猪霍乱沙门氏菌（CMCC 50018）、雏沙门氏菌[CMCC(B) 50047]、副溶血性弧菌(ATCC17802)、单增李斯特氏菌（CCTCC AB 97021）、金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]、大肠埃希氏菌（ATCC8099）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、阪崎肠杆菌（ATCC51329）、宋内氏志贺氏菌（CMCC51334），现保存于本实验室。

1.1.2 主要试剂和仪器

沙门氏菌培养基，北京陆桥有限公司。

试剂：Chelex-100，美国SIGMA；EMA，美国Biotium公司；Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR），宝生物工程(大连）有限公司；引物探针由珠海睿辉公司合成。

仪器：7500 FAST Real-Time PCR仪，美国Applied Biosystems 公司；光解仪，北京普林赛斯科技有限公司。

1.1.3 试验样品

根据GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》确认无沙门氏菌污染的样品共8份，奶粉、鸭蛋、蛋黄、猪肉、鸡肉、虾滑、三文治、饲料。

1.1.4 引物探针设计及特异性验证

根据GenBank中已发表的沙门氏菌的f imY基因（基因序列号：M90677.1），用Primer Premier 6引物设计软件设计引物和探针，由珠海睿辉公司合成。引物探针序列见表1。分别提取本实验室保存的7株沙门氏菌和其余7株非沙门氏菌的DNA作为模板进行RT-PCR，用以验证上述引物的特异性。

1.2 方法

1.2.1 沙门氏菌培养及其活菌和死菌菌悬液制备

将本实验室保存的沙门氏菌菌株（CCTCC AB 94018）纯培养物于0.85%生理盐水中混匀。根据本实验室前期已测得的麦氏浊度仪与沙门氏菌的浓度关系，制备活菌菌悬液并调节菌液浓度至2.5×10⁶ CFU/mL；取该浓度活菌菌悬液在水浴100℃下热致死10 min制备死菌悬液。同时，将处理后的菌悬液于NA平板上涂布计数，36℃培养48 h，以确定活菌菌悬液的准确浓度及死菌菌悬液是否完全灭活。

1.2.2 菌株DNA模板提取

采用10% Chelex-100提取方法：取菌悬液1 mL于灭菌离心管中，12000 r/min下离心5 min，弃上清，在沉淀中加入100 μL 10% Chelex-100溶液，剧烈振荡5～10 s；56℃水浴30 min，取出振荡，100℃水浴10 min，取出剧烈振荡5～10 s；12000 r/min下离心5 min，取上清液作为DNA模板。

1.2.3 RT-PCR检测体系的建立

RT-PCR反应体系（25 μL）：Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，正向引物1.0 μL（10 μmol/L），反向引物1.0 μL（10 μmol/L），探针1.0 μL（10 μmol/L），ddH₂O 7.5 μL，DNA模板2 μL。反应条件设置为：95℃预变性3 min；94℃变性5 s，60℃退火延伸40 s，同时收集FAM荧光，进行45个循环。Ct值＜36，可判定结果为阳性。

1.2.4 EMA的作用条件优化

（1）EMA工作液配制。1 mg EMA完全溶解于4 mL ddH₂O，配制成浓度为250 μg/mL的EMA储备液，避光冷冻保存。试验前用ddH₂O稀释成需要使用浓度的EMA工作液。

（2）抑制死菌DNA扩增的最低EMA浓度。取制备好的2.5×10⁶ CFU/mL死菌菌悬液于灭菌离心管中（制备方法见第1.2.1节），分别加入EMA工作液，使离心管内的EMA终浓度为0 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL，混匀后置于暗处反应5 min，然后放入光解仪中曝光10 min，按照第1.2.2节提取DNA后，采用第1.2.3节中的反应体系和条件进行RT-PCR反应。每组设置2个平行。

（3）最佳实验菌液浓度。取制备好的稀释度为10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL、10⁸ CFU/mL的活菌和死菌菌悬液，分别置于灭菌离心管中，加入按照第1.2.4节中（2）得到的EMA浓度工作液，设定暗反应时间为5 min，然后放入光解仪中曝光10 min，按照第1.2.2节提取DNA后，采用第1.2.3节中的反应体系和条件进行RT-PCR反应。每组设置2个平行。

（4）最佳暗反应时间的选择。取按照第1.2.4节中（3）得到的最佳实验菌液浓度的活菌和死菌菌悬液，分别置于灭菌离心管中，加入按照第1.2.4节中（2）得到的EMA浓度工作液，混匀后于暗处分别反应0 min、2 min、5 min、10 min、15 min、20 min，后置于光解仪中曝光10 min，活菌组与死菌组相同处理作为对照，按照第1.2.2节方法提取DNA后，采用第1.2.3节中的反应体系和条件进行RT-PCR反应。每组设置2个平行。

（5）最佳曝光时间的选择。取按照第1.2.4节中（3）得到的最佳实验菌液浓度的活菌和死菌菌悬液，分别置于灭菌离心管中，加入按照第1.2.4节中（2）得到的EMA浓度工作液，混匀，再按照第1.2.4节中（4）得到的暗反应时间反应后，置于光解仪中，分别进行0 min、2 min、5 min、10 min、15 min、20 min曝光，活菌组与死菌组相同处理作为对照，按照第1.2.2节方法提取DNA后，采用第1.2.3节中的反应体系和条件进行RT-PCR反应。每组设置2个平行。

1.2.5 EMA-RT-PCR的灵敏度试验

以2.5×10⁸ CFU/mL的活菌菌悬液作为初始稀释液，并将菌悬液进行10倍梯度稀释。取适当稀释度的菌液进行平板计数。取稀释度10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL、10⁸ CFU/mL的菌悬液于灭菌离心管中，加入按照第1.2.4节中（2）得到的EMA浓度工作液，于按照第1.2.4节中（4）的暗反应时间和（5）的曝光时间处理，按照第1.2.2节方法提取DNA后，采用第1.2.3节中的反应体系和条件进行RT-PCR反应。每组设置2个平行。

1.2.6 EMA-RT-PCR检测人工污染样品中沙门氏菌活菌

称取经国标方法检测沙门氏菌阴性的奶粉、鸭蛋、蛋黄、猪肉、鸡肉、虾滑、三文治、饲料各25 g，活菌组向样品分别加入菌浓度5 CFU/mL的沙门氏菌活菌菌悬液2 mL；死菌组向样品中分别加入2.5×10⁶ CFU/mL死菌菌悬液2 mL，将污染后的样品加入至225 mL BPW中均质，于36℃培养16 h；活菌组与死菌组相同处理作为对照，取1 mL均质液，12000 r/min下离心5 min，弃上清液，向沉淀中加入100 μL ddH₂O，振荡至沉淀完全悬浮，在上述EMA优化条件下处理，按照第1.2.2节方法提取DNA后，采用第1.2.3节中的反应体系和条件进行RT-PCR反应。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR引物、探针特异性验证

将本实验室保存的7株沙门氏菌和其余7株菌进行平板活化培养后用液体增殖，提取DNA模板进行验证，只有沙门氏菌属出现扩增曲线，其他菌均无扩增，表明引物、探针特异性良好，详情见表2。

2.2 菌悬液浓度测定

按照第1.2.1节方法制备和稀释处理的菌悬液，选取合适稀释度的活菌涂布平板后置于36℃培养24 h后，选取平板上30～300 CFU之间，无蔓延菌落生长的菌落为有效计数。经计算，活菌菌悬液浓度为2.5×10⁸ CFU/ mL；死菌菌悬液平板上均无菌落长出，表明水浴100℃ 10 min可使细菌完全热灭活，以此方法制备的菌液用于后续试验。

2.3 EMA工作条件优化及结果

2.3.1 抑制死菌DNA扩增的最低EMA浓度

取2.5×10⁶ CFU/mL死菌菌悬液，加入不同终浓度EMA，暗反应5 min，曝光反应10 min处理后，RT-PCR扩增的Ct值如图1所示。在浓度 0～30 μg/mL范围内，随着EMA浓度的逐渐增加，活菌组的Ct值为26～27，几乎没有变化，表明这些浓度下的EMA对活菌的扩增没有影响；死菌组在浓度 0～2.5 μg/mL范围内，随着EMA浓度的逐渐增加，Ct值上升较快，浓度2.5～30 μg/mL，死菌的Ct值为36～37，死菌的扩增受到抑制。因此，选择2.5 μg/mL作为EMA处理的最佳浓度。

图1 不同浓度EMA作用下的EMA-RT-PCR检测结果

Fig.1 Results of EMA-RT-PCR at different EMA concentration

2.3.2 最佳实验菌液浓度

取10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL、10⁸ CFU/mL浓度的活菌和死菌菌悬液，加入终浓度为2.5 μg/mL EMA，暗反应5 min、光反应10 min处理后，RT-PCR扩增Ct值如图2所示。在菌落浓度10²～10⁸ CFU/mL范围内，随着菌液浓度的上升，活菌组Ct值逐渐下降，10⁴～10⁸活菌的Ct值均＜36，活菌正常扩增，为阳性；菌液浓度10⁵～10⁸范围内，死菌组Ct值逐渐下降，10⁵～10⁶的Ct值均＞36，死菌被抑制；且死菌菌液浓度≤10⁴时，无法检测出Ct值。活菌和死菌之间的Ct值差值在10⁶时达到最大（ΔCt值＞10），并且该浓度的死菌被抑制。因此，选择2.5×10⁶ CFU/mL作为最佳实验菌液浓度。

图2 不同浓度菌液处理的EMA-RT-PCR检测结果

Fig.2 Results of EMA-RT-PCR with different concentration of bacterial solution

2.3.3 最佳暗反应时间

取2.5×10⁶ CFU/mL活菌和死菌菌悬液，加入终浓度，2.5 μg/mL EMA在0 min、2 min、5 min、10 min、15 min、20 min暗反应时间反应后，分别置于光解仪中曝光10 min，RT-PCR扩增Ct值如图3所示。在暗反应5～20 min范围内，随着暗反应时间的增加，活菌组Ct值均在26～27，没有明显变化，表明改变暗反应时间对活菌的扩增没有影响；死菌组暗反应时间为2 min时，死菌Ct值为31，还存在扩增反应，暗反应5～20 min时Ct值均＞36，且维持在36～37的范围，说明当暗反应≥5 min时，EMA对浓度为2.5×10⁶ CFU/mL死菌都能达到抑制扩增的效果。

图3 不同暗反应时间作用下的EMA-RT-PCR检测结果

Fig.3 Results of EMA-RT-PCR under different dark reaction time

2.3.4 最佳曝光时间

取2.5×10⁶ CFU/mL活菌和死菌菌悬液，加入终浓度为2.5 μg/mL EMA，暗反应5 min处理后，置于不同的曝光反应时间反应后，RT-PCR扩增Ct值如图4所示。曝光时间在2～20 min范围内，活菌组的Ct值均在26～27，没有显著性变化；死菌组DNA的扩增均受到抑制，呈现先上升后下降的趋势，10 min时，Ct值＞36，达到最大值。其余4个曝光时间的Ct值均＜36。曝光反应10 min时，活菌组和死菌组的Ct值结果相差最大，说明该曝光时间下EMA对死菌的抑制作用效果最好。

图4 不同曝光反应时间作用下的EMA-RT-PCR检测结果

Fig.4 Results of EMA-RT-PCR under different exposure time

2.4 灵敏度验证

根据fimY基因设计的引物探针对沙门氏菌10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL、10⁸ CFU/mL梯度浓度的检测结果如图5所示。由图显示，用EMA-RT-PCR方法检测10¹～10⁸ CFU/mL连续梯度稀释的沙门氏菌，10¹ CFU/mL未检出，其余梯度结果均匀稳定，该引物探针EMA-RT-PCR 方法的检测灵敏度为10² CFU/mL。

2.5 人工污染样品的检测

人工污染的奶粉和猪肉等8个样品经过PMA处理后检测结果如图6所示。结果显示，活菌组的Ct值在均在20左右，相当于10⁸活菌的浓度值；死菌对照组的Ct值＞38，均受到抑制，并且有4个样品未检出。经过EMA处理，活菌组的DNA扩增没有受到影响，而死菌组均能达到抑制死菌扩增的作用。

图6 人工污染样品的EMA-RT-PCR检测结果

Fig.6 EMA-RT-PCR results of artificially contaminated samples

3 结论

EMA-RT-PCR检测技术在食源性致病菌检测中应用越来越广泛。经过试验测试发现，菌株、试验条件、试剂配比等方面都是影响EMA作用效果的重要因素。目前已有针对副溶血性弧菌^[19-20]、金黄色葡萄球菌^[21]、大肠埃希氏菌O157: H7及弯曲杆菌等^[22-23]建立了EMA-RT-PCR检测技术的报道，并且该技术具有较高特异性，不仅可以弥补平板法的缺点，也能排除普通PCR因为死菌扩增检出假阳性的不足^[24]。本研究通过试验优化反应条件后确定：EMA浓度为20 μg/mL、暗反应5 min、曝光反应10 min条件下对10⁶ CFU/mL的沙门氏菌抑制效果最好，活菌扩增的Ct值为27左右，没有受到影响；死菌的扩增Ct值37左右，受到抑制。检测最低限值为10² CFU/mL。采用试验建立的EMA实时荧光PCR方法对8个人工污染样品进行检测，虽然某些样品对沙门氏菌DNA扩增产生一定抑制作用，但是并不影响检测结果，试验结果达到预期效果。

本研究建立的 EMA-RT-PCR 检测沙门氏菌的方法，检测过程只需4～5 h，时间大大缩短，并且能够较好地避免传统PCR方法中死菌的假阳性结果，完全能够满足食品安全监管的需要，具有广泛的应用前景。

参考文献

[1] Alves J, Niguma N H, De Oliveira TCRM. Detection of Salmonella spp. in Eight Complex Food Matrices Using Polymerase Chain Reaction Assay[J]. Journal of Food Safety, 2015, 35(4): 453-457.

[2] 李光辉, 高雪丽, 郭卫芸, 等. 1996—2015年间沙门氏菌食物中毒事件特征分析[J]. 食品工业, 2018, 39(5): 253-255.

[3] 何玉风, 杨菁, 汤晓召, 等. 2016—2018年云南省肉类制品致病菌污染状况调查分析[J].食品安全质量检测学报, 2019, 22(10): 7596-7600.

[4] 邱颖, 王宇卓, 张丽敏, 等. 2015—2017年河北省廊坊市食品中沙门氏菌污染状况及血清型监测分析[J]. 医学动物防制, 2019, 35(2): 134-136.

[5] Yan H, Li L, Alam M J, et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella in retail foods in northern China [J].International Journal of Food Microbiology, 2010, 143(3): 230-234.

[6] 庄平, 余以刚,周冬根, 等. SD-PMA-qPCR快速检测冷冻肉制品中活性沙门氏菌的研究[J]. 现代食品科技, 2017, 33(7): 289-294.

[7] Srisa-Art M, Ke B, Bj G, et al. Highly Sensitive Detection of Salmonella typhimurium Using a Colorimetric Paper-Based Analytical Device Coupled with Immunomagnetic Separation[J]. Analytical Chemis try, 2018, 90(1): 1035-1043.

[8] Techathuvanan C, D’souza D H. Reverse transcriptase loop mediated isothermal amplification as a rapid screening/monitoring tool for Salmonella Enterica detection in liquid whole eggs[J]. Journal of food science, 2012, 77(4): M200-M205.

[9] 王冠蕾. PMA-LAMP法可视化检测乳中沙门氏菌[J]. 中国乳品工业, 2020, 48(4): 51-54.

[10] 於颖, 王文静, 陆晔. PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究[J]. 检验医学, 2015, 30(5): 500-506.

[11] Xiao L, Zhang Z, Sun X, et al. Development of a quantitative real-time PCR assay for viable Salmonella spp. Without enrichment [J]. Food Control, 2015, 57: 185-189.

[12] 郑秋月, 赵彤彤, 袁慕云, 等. 实时荧光PCR检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌[J]. 食品科技, 2014, 39(2):297-301.

[13] 李聪聪, 余以刚, 邱杨, 等. PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157: H7[J].食品科学, 2012, 33(22): 217-220.

[14] 冯雪, 王冠蕾, 侯俊材. PMA/EMA-LAMP法应用于VBNC状态活菌检测的研究进展[J].中国乳品工业, 2020, 48(5): 37-41.

[15] Malorny B, Paccassoni E, Fach P, et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(12): 7046-7052.

[16] 向奋飞, 陈娟, 张晓娇, 等. EMA-qPCR检测金黄色葡萄球菌活菌方法的建立[J]. 职业与健康, 2020, 6(36): 1620-1622.

[17] 张俊彦, 梅玲玲, 徐昌平, 等. EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特氏活菌方法研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2017, 33(11): 1007-1012.

[18] 潘素华, 欧阳小明, 苏伟霞, 等. EMA和qPCR结合检测食品中活性肠出血性大肠杆菌O157: H7方法研究[J]. 现代预防医学, 2018, 45(15): 2809-2813.

[19] 伦镜盛, 夏长艳, 罗鹏, 等. 副溶血性弧菌EMA-PCR定量检测技术的建立[J]. 微生物学通报, 2011, 38(6): 952-956.

[20] 翁文川, 管锦绣, 谢会, 等. 水产品中副溶血性弧菌PMA-dd PCR活菌定量检测方法的研究[J].现代食品科技, 2019, 35(6): 273-279.

[21] 董蕾,刘慧敏,孟璐,等.快速检测金黄色葡萄球菌活菌的研究进展[J].食品工业, 2017, 38(10): 253-259.

[22] Chen J Q, Healey S, Regan P, et al. PCR-based methodologies for detection and characterization of Listeria monocytogenes, and Listeria ivanovii, in foods and environmental sources [J]. Food Science & Human Wellness, 2017, 6(2): 39-59.

[23] 陆星羽, 张宏斌, 张梦寒, 等. EMA-PCR方法检测饮用水中3种食源性致病菌活菌研究[J]. 现代预防医学, 2015, 42(10): 1845-1849+1885.

[24] Cattani F, Barth V C, Nasario J S R, et al. Detection and quantification of viable Bacillus cereus group species in milk by propidium monoazide quantitative real-time PCR[J]. Journal of Dairy Science, 2016, 99(4): 2617-2624.