马雪艺 黄玲 李燕 史茜 巴哈提古丽·马那提拜

绿脓杆菌也叫铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），是一种在自然界分布广泛的条件致病菌。当人体机体免疫力低下时，其通过感染受损的皮肤、眼部等部位侵入人体导致疾病，也可能引起败血症，具有较高的死亡率^[1-2]，被确认为食源性和水源性致病菌^[3]。在现行有效的化妆品微生物检测标准中绿脓杆菌也是常规检测的微生物项目之一。传统的检测方法包括微生物的增菌培养、分离及生化鉴定等，该过程耗时长，易受环境影响。目前，PCR技术和实时荧光PCR技术等分子生物学技术已经广泛应用于各个领域不同微生物的检测^[4]。本实验通过对新疆天然植物性特色染发产品——海娜粉中微生物菌种纯化分离，得到绿脓杆菌，将国标微生物生理生化鉴定技术与分子生物学方法结合，确认并完成对海娜粉中绿脓杆菌的检测分析，为提升天然植物化妆品中绿脓杆菌的检测和鉴定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）菌株：实验室标准菌株均为ATCC保藏中心菌株，购自北京陆桥生物科技有限公司，由乌鲁木齐海关技术中心食品安全微生物实验室复苏保存，参试菌株见表1。

表1 参试菌株及编号

Table 1 Tested strain and number

（2）仪器：恒温培养箱、Nikon-80i倒置显微镜（Nikon-80i）、PCR扩增仪、台式高速温控离心机、电泳槽、电泳仪、紫外凝胶成像仪、标准比浊管、高压蒸气灭菌锅，全部仪器设备都通过技术性验收或计量确认，均运转正常。

（3）培养基和试剂：SCDLP 液体培养基、十六烷基三甲基溴化铵培养基、绿脓菌素测定用培养基、明胶培养基、硝酸盐蛋白胨水培养，革兰氏染色液、API 20NE、TAE缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 50 bp DNA分离质量标准、琼脂糖、溴化乙锭、10×PCR Buffe，引物：GGCGTGGGTGTGGAAGTC（F） TGGTGAAGCAGAGCAGGTTCT（R）。

采用的培养基和相关试剂均按照国家标准^[5]验收，在有效期内按要求配制，以备灭菌使用。

1.2 方法

1.2.1 海娜粉中绿脓杆菌生理生化检测方法

（1）样品处理和培养：样品为海娜染发粉，固体粉末状。样品稀释后，取10 mL 样品稀释液接种至90 mL SCDLP 液体培养基中，在37℃培养24 h。如培养液表面多有一层薄菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色，表面样品中可能存在绿脓杆菌。进一步从培养液表面的薄膜处挑取培养物一环，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置恒温培养箱中37℃培养24 h。

（2）分离纯化和鉴定：绿脓杆菌在十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基上的典型菌落呈灰白色，表面湿润，菌落周围有扩散的水溶性色素。从分离纯化的平板上挑取可疑的菌落进行革兰氏染色，并采用API 20NE测试条进行生化鉴定。

1.2.2 PCR扩增技术试验方法

（1）DNA提取。采用煮沸法，将上一步进行初步分离纯化得到的菌株接种至增菌培养液中，于190 r/min 的摇床中37℃培养6 h。取培养液10 mL，煮沸5～10 min，冰浴10 min，再转12000 r/min离心5 min，取上清液，置-20℃ 保存。

（2）PCR引物设计。从GenBank下载所有靶基因的序列，应用oli907软件进行序列比对，并截取最一致的序列（表2）设计特异性引物，送至北京鼎国生物科技有限公司合成。

表2 绿脓杆菌gyrA特异性引物序列

Table 2 GyrA specific primer sequence of Pseudomonas aeruginosa

（3）PCR反应体系。本实验采用的PCR反应体系见表3。样品检测时，同时要设阳性对照和空白对照，阳性对照模板为绿脓杆菌阳性质粒，空白阴性对照为双蒸水。

表3 绿脓杆菌gyrA特异性基因PCR反应体系

Table 3 PCR reaction system for gyrA specific gene of Pseudomonas aeruginosa

（4）PCR反应程序：94℃ 预变性3 min；94℃变性60 s，60℃复性45 s，72℃延伸30 s 35个循环；最终在72℃再延伸7 min后，4℃保存。

（5）引物特异性验证：采用优化的PCR条件分别对表1中所列菌株进行检测。

2 结果与分析

2.1 生理生化特征结果分析

纯化分离得出的疑似目的菌经过革兰氏染色确认为革兰阴性菌，结合API 20NE生化试剂条得出结果，见表4。

表4 绿脓杆菌生化结果

Table 4 Biochemical results of Pseudomonas aeruginosa

2.2 PCR检测结果

2.2.1 PCR 扩增片段

海娜粉中分离出的菌株提取DNA，利用PCR扩增技术对绿脓杆菌gyrA特异性基因检测，得到扩增片段为65 bp目的条带，检测结果见图 1。

图1 PCR检测绿脓杆菌电泳结果

Fig.1 Electrophoresis results of Pseudomonas aeruginosa detected by PCR

2.2.2 PCR引物特异性验证

本实验结合绿脓杆菌的gyrA段基因序列进行特异性引物的设计，经过Primer-BLAST比对，筛选出的特异性的引物对，对照表1 所列菌株（包含绿脓杆菌标准菌株）均提取DNA进行PCR扩增，如图2，通道7为实验检出绿脓杆菌DNA扩增条带，通道9为绿脓杆菌标准菌株（阳性对照）DNA扩增条带，均得到清晰的目的条带，结果证实设计的引物特异性可以满足检测要求。

1. DNA Marker; 2. HN201301; 3. HN201302; 4. HN201303; 5. HN201304; 6. HN201305; 7. 实验室检出绿脓杆菌; 8. HN201306; 9. HN201307

图2 PCR检测绿脓杆菌引物特异性电泳结果

Fig.2 Primer specific electrophoresis results of PCR detection of Pseudomonas aeruginosa

3 讨论与结论

由于化妆品长期施用于人体皮肤表面，与使用者的健康密切相关，因此化妆品的卫生和安全非常重要^[6]。染发剂属于改变头发颜色的化妆品。通常天然植物性染发剂的主要成分是从天然植物中提取^[7]，海娜粉属于纯天然植物性染发剂，一直受到爱美女性的青睐。但是，天然植物产品在原材料收集、加工生产过程中都会存在微生物污染的可能性。目前国内外检测化妆品中绿脓杆菌的技术方法很多，有常规生化鉴定法^[8]、实时荧光PCR法、试剂盒快速检验法等，这些方法各有利弊。常规检测技术耗时较长，细菌的生化特征受环境影响较大，相对不稳定，手工生化鉴定的平行比也对细菌的鉴定结果造成误差^[9]；PCR凝胶电泳法快捷、成本低，实验室条件容易实现，但需要对细菌DNA提取条件优化、对设计引物特异性验证等操作，灵敏度相对较低。本文以实验室条件为基础，采用传统的生理生化结合PCR凝胶电泳技术，对本地天然植物源性化妆品中绿脓杆菌进行检验鉴定，达到缩短检验时长、提升分离效率、提高检测准确性的目的。

目前化妆品检测领域已有相应的分子生物学方法鉴定的行业标准，但纯天然植物性化妆品中微生物的检验标准尚且空缺，针对产品原材料的结构成分复杂，对部分细菌的鉴定存在一定技术要求，结合现有研究成果，未来可研究PCR结合高效液相色谱技术（PCR-DHPLC），针对微生物菌相组成稳定性、灵敏度等方面进行检测^[10]，进一步探讨化妆品使用过程中微生物污染变化情况。

参考文献

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