王粮子 林天闻 陈婷

中药是我国医药文化的瑰宝，中药化妆品以其来源于大自然，对皮肤作用温和、使用安全放心等特点，在追崇安全、绿色、健康的时代，日益受到广大消费者的青睐。一些中药具有明显的抗过敏和消炎作用^[1-3]，使用中药预防和改善皮肤过敏已经成为化妆品研制的热点^[4]。

黄芩又名山茶根、土金茶根，为唇形科黄芩属多年生草本植物，在我国北方各省均有种植。其提取物中具有药理活性的化学成分，主要为黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷等^［5-7］，具有明显的抗过敏、抗炎作用 ^[8-11]，被越来越多地应用到各类化妆品中。

本文介绍了一种使用甲醇超声波提取、超高效液相色谱（UPLC）分离、经紫外光谱阵列检测器检测、外标法定量，快速测定化妆品中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素3种功效成分的检测方法。黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素检出限均为4 mg/kg，定量限均为10 mg/kg，方法的回收率为84%～115%，相对标准偏差为3.0%～8.0%，8 min完成一个样品的检测，适合批量检测。同时辅以液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法来确认含量过低或液相灵敏度不够的样品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯），德国Merck公司；水为一级超纯水；乙酸、磷酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；黄芩苷（阿拉丁 B110209）；黄芩素（阿拉丁 B107323）；汉黄芩素（阿拉丁 W101155）。

标准储备混合溶液（1000 mg/L）：准确称取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3种标准物质各0.01 g，精确至0.00001 g，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容，标准储备溶液于-18℃下保存。

标准工作曲线：移取适量黄芩苷等标准储备混合溶液配制成黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素浓度均为0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL 的标准工作曲线。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC class，美国waters公司）；三重四极杆液质联用仪（TSQ QUANTUM ULTRA， 美国赛默飞公司）；Millipore超纯水一体机，美国Millipore公司；XS403S电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；AvantiJ-E高速离心机，美国Beckman公司；国产超声波清洗器。

1.3 实验方法

样品处理：准确称取样品0.5 g（精确至0.001 g）于10 mL塑料离心管中， 加入甲醇并定容至10 mL，漩涡2 min，超声15 min，于8000 r/min离心5 min，得到样品提取液。样品提取液过0.45 μm PTFE滤膜后用UPLC分析。

液相色谱法：色谱柱，C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相，甲醇和0.12% 磷酸水溶液梯度洗脱，洗脱梯度见表1；流速，0.4 mL/min；进样量，2 μL；柱温，室温；检测波长：278 nm。

表1 流动相梯度洗脱程序表

Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

液相色谱串联质谱法：色谱柱，C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相，甲醇＋ B：0.1%乙酸溶液＝80＋20等度洗脱；流速，0.15 mL/min；进样量，5 µL；离子源：电喷雾离子源；扫描方式，负离子扫描；检测方式，多反应监测；电喷雾电压，3500 V；离子源温度，300℃；

1.4 结果计算

按上述条件测定加标标准溶液和待测溶液，根据色谱峰的保留时间和紫外光谱图定性，根据加标标准溶液浓度和色谱峰面积回归直线方程定量，按公式计算如

式中，W：化妆品中黄芩苷等物质的含量，mg/kg；c：从标准工作曲线上查出的试样溶液中黄芩苷物质的浓度，mg/L；V：试样定容体积，mL；m：试样的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法选择

本研究比较了甲醇、乙醇和乙腈作为提取溶剂对回收率的影响，结果表明，甲醇作为提取溶剂可以取得较好的分效率和良好的峰形，所以选取甲醇作为提取溶剂。

2.2 检测波长选择

比较黄芩苷（图 1）、黄芩素（图2）和汉黄芩素（图3）的紫外吸收光谱，发现在278 nm 左右均有最大吸收峰，故选择作为方法检测波长。

2.3 方法的线性关系和检出限

化妆品中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的线性范围为0.25～20 μg/mL，相关系数R＞0.995， 表明线性关系良好。线性方程如表2所示。

表2 3种组分的线性范围和相关性

Table 2 Linear range and correlation of three components

取0.5 g空白化妆品加入一定浓度混合标准溶液， 用甲醇定容至10 mL，测试检出下限（信噪比S/N≥3），得到检出限均为4 mg/kg（图4），定量限均为10 mg/kg（图5）。

2.4 方法的回收率和精密度

分别称取0.5 g水、乳、霜3种剂型空白化妆品，并加入适量混合标准溶液，最后用甲醇定容到10 mL。分别得到黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均为10 mg/kg、20 mg/kg、100 mg/kg的加标样品（n＝8），进行回收率实验，如表3～5所示，回收率在84.5%～110%，相对标准偏差为0.38%～7.3%，符合化妆品相关要求。

为了使验证方法更加准确，同时请5家实验室一起验证本方法，验证数据见表6。

2.5 液相色谱串联质谱法

试验考察了T3色谱柱和C18色谱柱对化妆品中黄芩苷等3种组分分离情况的影响。结果表明：当采用C18色谱柱时，3种组分完全分离，保留时间（1.5～3.0 min），可快速鉴别3种物质，定性离子见表7。

2.6 实际样品测定

本研究测试了10个从市场购买的标称含有黄芩提取物的化妆品样品， 结果5个样品中检出黄芩苷成分，含量在10～70 mg/kg之间。

3 结论

本文建立了一种利用超高效液相色谱（UPLC）快速测定化妆品中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素3种功效成分的检测方法，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素检出限均为4 mg/kg，定量限均为10 mg/kg，方法线性范围0.25～20 μg/mL，方法的回收率为 84%～115%，相对标准偏差为3.0%～8.0%，8 min完成一个样品检测，适合批量检测。同时辅以液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法来确认含量过低或液相灵敏度偏低无法检测的样品。

参考文献

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[3]祝钧, 李子丹, 邓薇. 25种植物及单体抗敏抗刺激功效的筛选[J]. 亚太传统医药, 2011(5): 19-21.

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第一作者：王粮子（1985—），男，汉族，山东潍坊人，本科，助理工程师，主要从事化妆品和食品的研究，E-mail: wllscz@126.com

1. 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 上海 200137

2. 鲅鱼圈海关综合技术服务中心 营口 115007

1. Shanghai Customs Animal, Plant and Food Inspection and Quarantine Technology Center, Shanghai 200137

2. Bayuquan Customs Comprehensive Technical Service Center, Yingkou 115007

图1 黄芩苷紫外吸收光谱

Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of baicalin

图2 黄芩素紫外吸收光谱

Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of baicalein

图3 汉黄芩素紫外吸收光谱

Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum of wogonin

图4 检出限（LOD）4 mg/kg标准液相色谱图

Fig.4 Standard liquid chromatography with LOD of 4 mg/kg

图5 定量检出限（LOQ）10 mg/kg标准液相色谱图

Fig.5 Standard liquid chromatography with LOD of 10 mg/kg

表3 3种组份添加量为10 mg/kg的添加回收结果（n＝8）

Table 3 Addition and recovery results of three components with 10 mg/kg additions (n＝8)

表4 3种组份添加量为20 mg/kg的添加回收结果（n＝8）

Table 4 Addition and recovery results of three components with 20 mg/kg additions (n＝8)

表5 3种组份添加量为100 mg/kg的添加回收结果（n＝8）

Table 5 Addition and recovery results of three components with 100 mg/kg additions (n＝8)

表6 实验室间验证数据（n＝5）

Table 6 Interventricular validation data (n＝5)

表7 定性离子对、去簇电压和碰撞能量

Table 7 Qualitative ion pairs, clustering voltage and collision energy

注 : *为定量离子