王燕 傅科杰 华正江 冯云 冯睿

由于聚氨酯材料具有生物相容性优、材料安全性高、对人体皮肤友好等特点，同时耐水解并具有良好的抗菌性，使用生命周期长，易制作成各种医疗器械，因此被认为是最具价值的医疗领域相关原材料之一^[1]。该材料在人体泌尿系统、口腔和消化系统、心血管系统、骨骼系统和体外体表等领域都有着广泛的应用。医用聚氨酯材料在医用输液、输血、注射器具等方面取代PVC材料也是未来的发展趋势^[2]。2022年上半年，我国医疗器械对外贸易总额达4077.45亿元，其中出口额最高的商品是“未列名医疗塑料制品”（如输液管、医用塑料吸管等），出口额达702亿元，占比27.91%^[3]；而聚氨酯材料广泛被用于医疗塑料制品中，因此对其可预见医疗用途中有毒有害单体残留的监控显得尤为重要。

聚氨酯常采用二苯甲烷二异氰酸酯单体聚合而成。二苯甲烷二异氰酸酯简称MDI，其化学式为C₁₅H₁₀N₂O₂，有2,2’-二苯甲烷二异氰酸酯、4,4’-二苯甲烷二异氰酸酯、2,4’-二苯甲烷二异氰酸酯等多种异构体，其中，应用最广泛的是4,4’-二苯甲烷二异氰酸酯，其化学结构式见图1。

图1 4,4’-二苯甲烷二异氰酸酯结构式

Fig.1 Structural formula of 4,4’-diphenylmethane diisocyanate

有研究发现对小鼠不断给药，二苯甲烷二异氰酸酯材料在与血液接触后会快速分解，它相应的分解物为4,4’-二氨基二苯甲烷（MDA）^[4-5]。国际癌症研究组织（IARC）将MDI定义为3级，即对人类不具备致癌性，其中MDA定义为2B级，即对人类存在可能致癌^[6]。对于聚氨酯类医疗器械，特别是与人体直接接触的医疗器械产品，需要对材料中的异氰酸酯单体残留量及其安全性影响进行评估^[7]。

由于MDI化学性质活泼^[8]，对于MDI的检测通常采用衍生化的方法来进行，常用的衍生试剂有9-甲氨甲基蒽^[9]、二正丁胺^[10]、1-（2-吡啶基）哌嗪^[11]、无水甲醇^[12-13]等。本文根据YY/T 1550.2-2019《一次性使用输液器具与药物相容性研究指南 第2部分：可沥滤物研究 已知物》中4.1浸提液的制备中的规定，将分子筛脱水的无水甲醇作为浸提溶剂进行极限浸提，同时利用MDI与甲醇发生衍生化反应，生成二苯甲烷二氨基甲酸甲酯（MDC），通过高效液相色谱法测定MDC的含量，推导出MDI溶出量，优化了实验条件，并进行精密度、线性回归、回收率、检出限的验证试验，并且根据GB/T 16886.17-2005《医疗器械生物学评价 第17部分：可沥滤物允许限量的建立》探讨了MDI溶出量在医用材料的安全区间。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

4,4’-二苯甲烷二异氰酸酯标准品（4,4’-MDI，CAS：101-68-8）购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇（色谱纯）购自德国Meker公司，使用前经分子筛（4A，钠A型）脱水；水为超纯水。实验样品为进出口医用聚氨酯静脉输液管6批次、静脉留置针4批次、一次性使用压力延长管3批次和血液透析导管2批次。

1.2 主要仪器与设备

U3000 DAD高效液相色谱仪配紫外检测器（赛默飞科技有限公司），Mettler AE260 Delta Range型电子分析天平（梅特勒-托利多国际有限公司），HH-6数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），RV10旋转蒸发仪（德国IKA公司）。

1.3 实验条件

1.3.1 样品前处理

取出样品中聚氨酯材质的管路部分，剪碎至约1 cm，称量质量后放入圆底烧瓶中，加入100 mL甲醇并于（37±1）℃恒温水浴72 h，得到浸提液。同样方法不加样品制备空白溶液。分别将浸提液和空白溶液在40℃用真空旋转蒸发，再添加2 mL乙腈进行进一步溶解，通过0.45 μm尼龙滤膜过滤，获得相应的供测试液和空白试液。

1.3.2 标准溶液的配制

称取4,4’-MDI标准品10 mg，加入100 mL无水甲醇，于（37±1）℃水浴加热72 h，40℃旋转蒸发至近干，用无水甲醇定容10 mL，配成质量浓度为1 mg/mL的对照品储备液，4℃冰箱中冷藏，可放置1个月。临用前用无水甲醇稀释至适当浓度，备用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为Dikma Diamonsil C₁₈(2)柱，粒径5 μm，Ø4.6 mm×250 mm；流动相采用乙腈-水梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为245 nm。

表1 梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution procedure for HPLC

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的选择

2.1.1 衍生剂用量优化

实验优化了衍生试剂的用量，在5支离心管内各加入100 μL用乙酸乙酯配制200 μg/mL的MDI标准溶液，用氮气吹干，分别加入10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL的无水甲醇，并用乙腈补足至1 mL，用HPLC按照1.3.3的条件进行测试，对甲醇用量和MDC的峰面积作图，结果见图2。

从图2可以看出，随着甲醇量的增加，MDC的峰面积增大，当甲醇的用量达到200 μL时，MDC的峰面积达到稳定，因此衍生试剂与MDI的比例（V/m）大于10:1时，MDC的峰面积不再增加，认为此时已达到最高转化率。

图2 甲醇用量对MDC峰面积的影响

Fig.2 Effect of methanol dosage on MDC peak area

2.1.2 衍生温度优化

实验优化了衍生温度对MDC峰面积的影响，在5支离心管内各加入100 μL用乙酸乙酯配制200 μg/mL的MDI标准溶液，氮气吹干后加入1 mL无水甲醇，将其分别在4℃冰箱、室温及37℃、50℃、70℃的烘箱中放置12 h，取出后用HPLC按照1.3.3的条件进行测试，对甲醇用量和MDC的峰面积作图，结果见图3。可以看出，温度对衍生化反应的影响不大，从4～70℃均可完全反应。

图3 反应温度对MDC峰面积的影响

Fig.3 Effect of reaction temperature on MDC peak area

2.1.3 衍生时间优化

实验优化了衍生时间的影响，在5支离心管内各加入100 μL用乙酸乙酯配制200 μg/mL的MDI标准溶液，用氮气吹干，加入1 mL甲醇并开始计时，达到相应时间立刻用HPLC按照1.3.3的条件进行测试，对反应温度和MDC的峰面积作图，结果见图4。可以看到，甲醇一旦加入，衍生化反应即时启动，随着时间延长，MDC的量先增加后趋于稳定，认为反应已经完成。因此在加入甲醇12 h后，衍生化反应完成。

图4 反应时间对MDC峰面积的影响

Fig.4 Effect of reaction time on MDC peak area

2.2 HPLC对MDI的甲醇衍生物的定量检测

2.2.1 检测波长的选择

配制20 μg/mL的MDC标准溶液，在200~400 nm波长进行紫外扫描，结果见图5。从图5可以看出，MDC的最大吸收波长为245 nm，因此本实验选择检测波长为245 nm。

图5 MDC的紫外扫描谱图

Fig.5 UV scanning spectrogram of MDC

2.2.2 检测可行性分析及标准曲线的建立

采用HPLC对MDI的甲醇衍生物MDC进行测定，色谱图如图6所示。可以看出，MDI的甲醇衍生物MDC的出峰时间在5.217 min，峰型对称且无干扰，符合检测要求。以浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标进行线性回归拟合，结果表明在0.5～100 μg/mL浓度范围内峰面积与浓度呈线性关系（图7），相关系数R²＝0.9999，回归方程y＝1.3210x－0.2051。

图6 4,4’-MDI 的甲醇衍生物MDC的HPLC色谱图

Fig.6 HPLC chromatogram of 4,4’-MDI methanol derivative MDC

图7 4,4’-MDI 的甲醇衍生物MDC的线性

Fig.7 Linearity of 4,4’ - MDI methanol derivative MDC

2.2.3 检出限和定量限

取MDI的甲醇衍生物MDC储备液逐级稀释，将得到的低浓度标准溶液进行检测，当信噪比S/N为3时，浓度为0.05 μg/mL，因此检出限定为0.05 μg/mL（图8a）。当信噪比S/N为10时，浓度为0.1 μg/mL，因此定量限定为0.1 μg/mL（图8b）。

2.2.4 加标回收率

采用HPLC法对MDI的甲醇衍生物MDC进行测定，分别对空白样品加标1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、50.0 μg/mL的MDI标准品，每组6个平行测定其加标回收率，结果见表2。低、中、高三水平加标平均回收率分别为83.5%、96.2%和98.7%，RSD分别为0.79%、0.13%和0.37%，回收率符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》标准中附录F检测方法确认技术要求。

2.2.5 精密度

取MDI衍生物MDC储备液配制成浓度为10.0 μg/mL的标准溶液，设置6个平行实验组、连续测定3 d，分别计算RSD值，测试结果如表3所示。可以看出，使用HPLC法连续6次测定MDI甲醇衍生物MDC的RSD为0.10%，连续3 d测试的RSD为0.91%，表明检测结果稳定，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》标准中附录F检测方法确认技术要求，表明该方法精密度高。

2.3 实际样品检测

将取出样品中含有MDI的管路部分称重，切碎至约1 cm，加入100 mL 甲醇并保持在（37±1）℃中72 h，得到浸提液。同法不加样品制备空白液。分别取空白液和浸提液在40℃下用真空旋转蒸发，再添加2 mL乙腈进行进一步溶解，通过0.45 μm尼龙滤膜过滤后上机测试。同时，同样操作进行加标回收实验。

对15个批次的聚氨酯材质的医疗器械的MDI溶出物进行测定，结果见表4，加标回收结果见表5。经测试，15批次的测试样品中有11批次未检测到MDC，在1个批次的静脉留置针、1个批次的静脉输液管和2个批次的血液透析导管中检测到MDI的甲醇衍生物MDC，含量均在5.0 μg/套以下，加标回收率在95.5%～96.8%之间。

表4 样品测试结果

Table 4 MDI dissolution results of medical devices

注: ND代表未检出, 即＜0.1 μg/套。

表5 样品加标回收率

Table 5 Recoveries for MDI of medical devices

注: ND代表未检出, 即＜0.1 μg/套。

3 讨论

由于测试的样品中有＞1/4的样品中检测到MDI残留，可能是个别材料中的异氰酸酯单体未聚合完全，因此需要对MDI的可耐受限量进行推导。本次试验样品均为血液接触类产品，MDI在进入血液后，会分解成为MDA^[4-5]。美国有毒物质和疾病登记署（ATSDR）及美国国家卫生基金会（NSF）在科学评估 MDA的毒性后，其根据小鼠不断给药12周得到的最小安全剂量值为 8.3 mg/(kg·d)，当采用不确定因子为100（100＝物种间差异×人体间差异，物种间差异取10，人体间差异取10），得出人员短期每日安全剂量值为0.083 mg/(kg·d) ，即为可耐受摄入量（Tolerable Intake，TI）值^[4,14]。采用参考文献[15]中的公式推导，可耐受接触（Tolerable Exposure，TE）的计算公式，可耐受接触TE＝可耐受摄入量TI×医疗器械接触群体的体重m×应用因子UTF，而应用因子UTF＝多器械接触因子CEF×比例接触因子PEF，比例接触因子PEF＝解除类别的天数n_exp/医疗器械使用的天数n_use，所以TE＝TI×m×CEF×( n_exp/n_use)，公式中：TI耐受摄入量为0.083 mg/ (kg·d) ；体重m以70 kg计，则 MDA 的可耐受限量 TE＝0.083×70×0.2×(30/30) ＝1.162 mg/次，因实验产品为一次性使用，因此认为产品中MDA的最高溶出限量为1.162 mg/套。假设溶出的MDI全部转化为MDA，则反应式为：

(C₆H₄NCO)₂CH₂+2H₂O→(C₆H₄NH₂)₂CH₂+2CO₂即1.162 mg MDA对应1.467 mg MDI，因此认为产品中MDI的最高溶出限量为1.467 mg/套。

根据甲醇模拟溶出试验结果，本次测试的产品中MDI溶出量小于5.0 μg/套，因此可认为此次试验产品的MDI溶出量在医用材料的安全区间内。

4 结论

本研究以甲醇作为提取溶剂和衍生化试剂，衍生反应迅速完全，且无副产物，衍生试剂价格低廉。结果表明本研究方法在0.5～100 μg/mL范围内线性关系良好，平均加标回收率为83.5%～98.7%，日内精密度和日间精密度分别为0.10%（n＝6）和0.91%（n＝3），说明该方法具有较高的准确度和精密度，能够满足进出口医疗器械中MDI溶出量的测定需求。对15批次的进出口医疗器械进行了测试，结果在1个批次的静脉留置针、1个批次的静脉输液管和2个批次的血液透析导管中检测到MDI的甲醇衍生物MDC，含量均在5.0 μg/套以下。通过对MDI最高溶出限量的推导，认为此次检出MDI溶出的4个批次进出口医疗器械的MDI溶出量均在安全范围内。

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表2 HPLC法测定MDI含量的加标回收率

Table 2 Recovery of MDI content determined by HPLC

表3 精密度测试结果

Table 3 Results of precision test

a

b

图8 4,4’-MDI 的甲醇衍生物MDC的

检出限（a）和定量限（b）

Fig.8 Detection limit (a) and quantitation limit (b) of 4,4’-MDI methanol derivative MDC

基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（202112060725），山东省学校卫生协会科研项目（SDWS2022192），济宁市重点计划研发
项目（2021年医学研究和临床医学类-18）

第一作者：张杨（1988—），男，汉族，山东兖州人，本科，主管技师，主要从事微生物检验，E-mail: 502971237@qq.com

通信作者：焦伯延（1983—），男，汉族，山东济宁人，博士，副主任技师，主要从事微生物检验，E-mail: j198319831983@126.com

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