张杨 郭培全 岳营 江亚娟 窦慧馨 贾勇健 王小羽 焦伯延

Abstract To analyze the epidemiological characteristics and the complete genome characteristics of influenza A (H3N2) virus outbreak in a school, so as to provide research data for prevention and control of influenza in school. The epidemiological investigation was carried out on influenza A (H3N2) virus outbreak in a school and 17 nasopharyngeal swabs collected were detected for influenza virus nucleic acid detection, virus culture and whole-genome sequence. The genetic variation characteristics of the whole-genome sequence were analyzed by bioinformatics software. 4 nasopharyngeal swabs were positive with influenza A (H3N2) virus nucleic acid. 2 strains of influenza A (H3N2) virus were cultured, and the sequences of 2 strains were highly homologous. Compared with the vaccine strain A/Kansas/14/2017, the consistency range of the eight gene segments was 96.71%-98.88%. In the evolutionary tree, 2 sequences and vaccine strains were not in the same evolutionary branch, and were far related. The signal peptide of HA protein had 2 amino acid variations, and the antigen epitope and receptor binding site had 5 and 2 amino acid variations, respectively. Amantadine resistance sites were mutated. None NA inhibitor resistance sites were mutated. PA had K158R mutation, and PB2 had K340R mutation. The pathogen of the school outbreak was influenza A (H3N2) virus. HA exhibit antigenic drift. The monitoring and prevention of influenza in schools should be strengthened.

Keywords influenza A (H3N2) virus; complete genome characteristics; outbreak in schools

流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种常见呼吸道传染病，以发热、咳嗽等为主要临床症状，人群普遍易感。流感是全球面临的公共卫生问题之一，每年导致全球29万～65万人死亡，此外，流感造成的经济负担较大，在我国每年造成约264亿元的经济负担^[1]。

流感病毒根据蛋白抗原性的不同分为甲型、乙型、丙型和丁型4种型别，其中甲型流感病毒是流感病毒中最重要的型别之一，甲型流感病毒全基因组包含8个基因节段，编码10种以上病毒蛋白^[2-3]。根据血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性不同，甲型流感病毒分为不同的亚型^[4-5]。季节性H3N2流感病毒自1968年首次暴发以来，经过不断地进化变异，逐渐成为主要的季节性流感病毒之一^[5-6]。

学校人员密集，是流感聚集暴发的主要场所^[7-8]。本研究对2019年济宁市兖州区一起学校季节性H3N2流感聚集疫情开展流行病学调查、实验室检测和全基因组测序，了解学校流感聚集疫情的流行特点和全基因组特征，为流感的科学防控提供依据。

1 材料和方法

1.1 标本采集

按照《全国流感监测方案（2017年版）》采集聚集疫情咽拭子标本17份。

1.2 核酸检测和病毒培养

取350 μL咽拭子标本利用MagNA Pure LC 2.0核酸提取仪（Roche公司）利用磁珠法进行核酸提取，利用广州达安基因生物科技有限公司生产的甲型H1N1（货号：DA2391）、季节性H3N2（货号DS0092）、BV谱系（货号：D0970）和BY谱系（货号：D0960）流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）配置反应体系，利用LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪（Roche公司）进行检测，具体操作详见试剂盒说明书。

核酸检测阳性样本接种MDCK细胞，35℃孵育3～4 d后，收获培养物进行流感病毒滴度鉴定。

1.3 全基因组测序和分析

利用MiSeq测序仪（illumina公司）对培养的2株毒株进行流感病毒全基因组测序。在GISAID数据库下载疫苗株等季节性H3N2流感病毒全基因组序列25条。疫苗株A/Kansas/14/2017的GISAID编号为EPI_ISL_292575 。利用DNASTAR 7.0.1和MEGA 7.0.14软件进行同源性分析；利用MEGA 7.0.14软件进行序列比对和进化树构建；利用SignalP-3.0进行信号肽分析；利用NetNGlyc-1.0、NetPhos-3.1、GPS-SUMO分别进行糖基化位点、磷酸化位点和SUMO化位点分析。

2 结果

2.1 流行病学调查和实验室检测

本次学校聚集疫情共报告37例流感样病例，2019年12月19日出现首例病例，20—23日共19例，24日17例。发病学生均在同一个班级，班级罹患率为77.08%（37/48），发病年龄6～7岁，男女比例0.95:1。临床症状主要是发热、咳嗽，无重症和住院病例。12月24日采集流感样病例咽拭子标本17份，经实时荧光定量PCR检测季节性H3N2流感病毒阳性4份，阳性率23.53%。分离2株病毒毒株，分别命名为A/shandongyanzhou/332/2019 (H3)和A/shandongyanzhou/339/2019 (H3)。

2.2 序列分析

对2株毒株进行全基因组测序，均获得流感病毒8个基因节段全基因序列。2条序列的HA、NA、PA、NP、MP、NS基因完全相同，PB1和PB2基因及编码蛋白存在差异。与2019—2020年北半球疫苗株A/Kansas/14/2017相比，8个基因节段的核苷酸一致性为96.71%～98.88%，其中HA基因一致性最低；编码蛋白的一致性为95.79%～100%。见表1。

2.3 进化分析

利用2株毒株序列、疫苗株A/Kansas/14/2017序列、部分我国和全球序列进行比对，并构建8个基因节段的进化树。在进化树上，2条序列的8个基因节段与疫苗株均不在同一进化分支。在HA基因进化树上，与疫苗株A/Kansas/14/2017位于3C.3a进化分支不同，2条序列位于3C.2a1b进化分支，见图1。

2.4 HA信号肽变异分析

与疫苗株A/Kansas/14/2017序列相比，2条序列HA蛋白的信号肽均发生了C9Y和A16T变异。利用SignalP-3.0分析HA的信号肽序列，发现第9位氨基酸位于信号肽的中心疏水区（central hydrophobic region，H区），第16位氨基酸位于信号肽的羧基末端区（carboxy-terminal cleavage-region，C区）。C9Y和A16T的变异均没有改变信号肽的切割位点，均在第16～17位氨基酸之间切割，见图2。

2.5 病毒分子特征分析

2.5.1 抗原表位分析

HA的抗原表位包括A区（133～137、140～146位氨基酸）、B区（156～160、187～198位氨基酸）、C区（52～54、275、277～278位氨基酸）、D区（174和207位氨基酸）、E区（63、78、81、83位氨基酸）。与疫苗株相比，2条序列HA的抗原表位发生5处氨基酸变异，其中包括位于A区的T135K、S137F、F144S和位于B区的S159Y、K160T，见表2。

2.5.2 受体结合位点分析

HA受体结合位点包括130环（135～138位氨基酸）、190螺旋（187～194位氨基酸）、220环（225～228位氨基酸），与疫苗株相比，2条序列HA的受体结合位点发生2处氨基酸变异，均是位于130环的T135K和S137F，见表2。

2.5.3 耐药位点分析

季节性H3N2流感病毒M2蛋白的31位氨基酸是金刚烷胺耐药的关键位点，N31能够致使金刚烷胺耐药，2条序列和疫苗株序列31位氨基酸均是N，说明均是金刚烷胺耐药株。NA蛋白发生E119A、R224K等位点变异能够引起NA抑制剂耐药，2条序列NA抑制剂耐药位点均未发生变异。

2.5.4 聚合酶变异分析

2条序列的PA发生K158R和K626R变异。2条序列的PB1均发生E618D变异，A/shandongyanzhou/332/2019 (H3)发生了I667V变异，A/shandongyanzhou/339/2019 (H3)发生了E97K变异。2条序列的PB2均发生S107N、K299R、K340R、V444I和I584V变异，A/shandongyanzhou/332/2019 (H3)发生了I19R变异。

2.5.5 翻译后修饰分析

利用NetNGlyc-1.0 分析糖基化位点，HA发生的T135K变异，致使133～135位氨基酸由NGT改变为NGK，丢失N133糖基化位点；K160T变异，使158～160位由NSK改变为NST，增加N158糖基化位点。

利用NetPhos-3.1分析磷酸化位点，HA发生的K144S变异，增加S144磷酸化位点，发生的S159Y变异，丢失S159磷酸化位点。NA发生的I62T变异，增加T62磷酸化位点，发生的S315R变异，丢失S315磷酸化位点。

利用GPS-SUMO分析SUMO化位点，2条序列PB2发生的K340R变异，丢失K340的SUMO化位点。

3 讨论

造成本次学校流感样病例聚集疫情的病原体是季节性H3N2流感病毒，培养出2株毒株，获得2条全基因组序列。在进化树上，8个基因节段均与疫苗株不在同一进化分支，遗传距离较远。2条序列在进化树上均位于3C.2a1b进化分支，与2019—2020年度济宁市季节性H3N2流感病毒测序分析结果一致^[9]。

信号肽位于分泌蛋白的N端，一般含15～30个氨基酸，包括3个区，即氨基末端区（amino-terminal region，N区）、H区和C区^[10]。HA蛋白N末端含有信号肽，信号肽对HA蛋白的表达、定位、成熟、糖基化等至关重要^[11-12]。本研究2条序列的HA信号肽发生了2处氨基酸变异，但2处氨基酸变异没有改变信号肽的切割位点。然其对HA表达、定位等的影响暂不明确。

HA变异能够改变病毒的抗原性，影响疫苗的保护效果。HA抗原表位发生4个以上的变异，且至少分布在2个以上的抗原表位区，即发生抗原漂移，产生具有流行病学意义的新变种^[13]。2条序列在抗原表位的A区发生3个氨基酸位点变异，B区发生2个氨基酸位点变异，符合具有流行病学意义的新变种。此外，抗原表位翻译后修饰发生了改变，丢失了位于A区的N133糖基化位点，增加了位于B区的N158糖基化位点，增加了位于A区的S144磷酸化位点，丢失了位于B区的S159 磷酸化位点。这些糖基化位点和磷酸化位点的改变可能影响HA的抗原性。HA是流感病毒的受体结合蛋白^[14]，2条序列HA的受体结合位点130环均发生T135K和S137F变异。其中，135位氨基酸由不带电荷的T变异为带正电荷的K，改变了130环的电荷，可能对受体结合产生影响。

M2和NA是治疗甲型流感的关键靶点^[15]。金刚烷胺能够结合M2蛋白的跨膜区并堵塞离子通道，抑制病毒复制过程。然而，M2蛋白31位氨基酸变异为N时，药物无法结合M2蛋白，引起耐药性^[16]。本研究2条序列M2蛋白31位氨基酸均为N，说明金刚烷胺不适用于治疗流感。NA抑制剂是目前治疗流感的最常用的药物之一^[17]，2条序列均未发生NA抑制剂的耐药，说明目前NA抑制剂治疗流感有效。

PA、PB1和PB2构成流感病毒的聚合酶^[2]，2条序列的PA均发生K158R变异，K158R变异可以增强聚合酶活性^[18]。SUMO化是PB2重要的蛋白翻译后修饰方式之一，SUMO化的PB2蛋白稳定性降低，聚合酶的活性减弱^[19]。2条序列PB2丢失K340的SUMO化位点，可能干扰宿主对PB2蛋白的SUMO化修饰，保持聚合酶的活性。

4 结论

综上所述，本研究对一起学校聚集流感疫情进行流感病毒核酸检测、病毒培养和全基因组测序分析，明确导致本起疫情的病原体是季节性H3N2流感病毒，全基因组测序显示本次疫情毒株编码的蛋白发生多个位点的变异。提示学校人员高度密集，容易发生流感聚集疫情，应加强学校的流感监测和健康教育，强化学生的流感疫苗接种，减少聚集疫情的发生和蔓延。

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表1 序列分析

Table 1 Sequence analysis

■表示本研究分离株；●表示疫苗株A/Kansas/14/2017

图1 季节性H3N2流感病毒8个节段基因进化树分析

Fig.1 Phylogenetic tree of 8 gene segments of influenza A(H3N2) virus

A-疫苗株A/Kansas/14/2017的HA信号肽分析; B-济宁2条序列HA信号肽分析

图2 HA信号肽分析

Fig.2 Signal peptide analysis of HA

表2 HA抗原表位和受体结合位点氨基酸变异分析

Table 2 Amino acids mutation analysis of antigen epitopes and receptor binding sites of HA

基金项目：广东省市场监督管理局科技项目（2020CS09）

第一作者：张琼丹（1994—），女，汉族，广东高州人，本科，助理工程师，主要从事微生物检验，E-mail: 1947783054@qq.com

通信作者：雷柳冰（1977—），女，汉族，广东东莞人，本科，副主任药师，主要从事微生物检验，E-mail: 115073974@qq.com

1. 东莞市食品药品检验所 东莞 523808

1. Dongguan Institute for Food and Drug Control, Dongguan 523808