胡玲 朱海强 程玉文

Abstract A rapid and simple analytical method able to identify nosiheptide in livestock and poultry meat was established. A mixture of acetonitrile and dichloromethane was used for homogenate extraction. After n-hexane degreasing, the extract was blown to near dry by nitrogen. After hydrolysis with 1 mol/L sodium hydroxide at 80℃ for 1 h, n-hexane was degreased again, and retained by BEH C₁₈ column, a good peak shape was obtained. UPLC-MS/MS was analyzed in negative electrospray ionization mode. The results showed that the optimized pretreatment method could fully remove the interference of complex matrix with good specificity and sensitivity. The limit of quantitation (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were 2.5 µg/kg and 5 µg/kg, respectively. The linearity of matrix-matched addition curves were no less than 0.9950. Average recoveries of the spiked chickens were in the range from 94.4% to 108.6% with associated RSD values from 3.9% to 8.3%. The inter-assay coefficient of variation was 4.5%. Average recoveries of the spiked pork were in the range from 92.1% to 111.1% with associated RSD values from 3.0% to 5.5%. The inter-assay coefficient of variation was 3.4%.

Keywords nosiheptide; pretreatment; LC-MS/MS

那西肽是一种由微生物发酵方式获得、带有5个噻唑环的含硫多肽类动物专用抗生素。它通过抑制细菌蛋白质合成而起抗菌作用，对革兰氏阳性菌，特别是葡萄球有较高的活性。作为一种具有抵抗病菌、促进动物生长作用的新型饲料添加剂，它能显著提高饲料效率，而且不易产生耐药性，属于非吸收型饲料添加剂，具有残留极低、对环境影响小、对人畜毒害小等特点^[1-4]。目前，欧盟和日本已批准并广泛使用。在我国，农业农村部公告第1923号规定了那西肽添加到猪和鸡的饲料中，每1000 kg配合饲料，猪和鸡饲料添加量分别为2.5～20 g和2.5 g，休药期为7 d，但对产蛋鸡则是禁用。那西肽不仅广泛应用于畜禽业，而且还有广泛应用于水产业的潜力^[5]。

同时，那西肽也存在一定的毒性，若长期过度添加或滥用会导致残留超标，引发食品品质甚至食品安全问题^[3,5-8]。因此，加强动物源性食品中那西肽监测非常必要。日本“肯定列表制度”中规定了那西肽在肌肉和组织中的残留最高限量均为0.03 mg/kg。关于动物源性食品中那西肽的检测方法目前报道很少，配有负化学电离的气质联用（GC-MS-CI）^[6]、配有荧光检测器的液相色谱（HPLC-FLU）^[7-10]和液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）^[11-12]等3类分析方法均有应用。GC-MS方法需要进行衍生化，在负化学电离模式下，检测限可以达到0.1 µg/kg，缺点是操作步骤繁多，对复杂基质检测质量欠佳。HPLC法则前处理较为简便，检测限一般在50～500 µg/kg之间，尽管通过荧光检测器，检测限可以达到5 µg/kg^[8]，但特异性不高，对于阳性样品无法进行确证。当前普遍认为，采用间接法的LC-MS/MS方法是最为理想的。其前处理方法一般采用1 mol/L NaOH溶液水解获得4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸(HMIA)片段，用正己烷除脂后，水解液进一步经阴离子交换固相萃取小柱净化，反相柱保留，在负离子模式下进行分析，具有特异性强、灵敏高的特点^[11-12]。但是，该方法也存在处理步骤相对较为烦琐、效率偏低等缺点。为了进一步提高检测通量，我们对该检测路线进行了一定的优化，取得了满意效果。

1 实验部分

1.1 化学品和试剂

那西肽标准物质购自美国First Standard公司，浓度100 μg/mL；用甲醇稀释成500 ng/mL工作溶液，-18℃保存，甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸铵和正己烷等试剂为HPLC级别，由美国天地公司提供；水由Milli-Q纯水仪（Millipore）纯化得到，其他试剂为国产分析纯。

1.2 前处理

称取粉碎后的猪肉或鸡肉样品5 g（精确到0.01 g）于50 mL刻度离心管中，加入吸水剂无水硫酸镁6 g，加入20 mL乙腈+二氯甲烷混合溶液（V/V＝6:1），以15000 r/min匀浆3 min，用上述提取液定容至35 mL刻度线。加入正己烷10 mL，在0℃下，以4500 r/min离心5 min，弃去上清液。接着用正己烷重复去脂一次。取约10 mL下层提取液到另一只15 mL离心管中，在40℃水浴中，氮吹至近干。加入1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，置于80℃下水浴震荡水解1 h。恢复室温后，用甲酸调整pH值至6～7之间，用75%甲醇定容至4.0 mL刻度线，加入2 mL正己烷，混匀静止5 min后，下层经孔径为0.2 μm的尼龙滤膜过滤至1.5 mL进样瓶中，供UPLC-MS/MS测定。

1.3 UPLC-MS/MS 分析

流动相A和B分别为甲醇和水（含氨水0.3%）；梯度洗脱条件为（t in min）：t＝0， A＝5%； t＝6，A＝20%；t在6～10之间时，A＝100%，t＝10.1，A＝5%，保持2.5 min；进样量为10 μL；通过流路切换，使得4～6 min期间进行质谱采集，其余时段的色谱柱流出液进入废液。其他仪器条件均参照文献[13]。

1.4 方法验证

在5.00 g空白样品中分别加入混合标准溶液0 μL、10 μL、25 μL、100 μL、250 μL、500 μL标准溶液，用来制作基质添加标准曲线。

对15个不同的空白样品进行前处理并分析，考察潜在的干扰峰。在5.00 g空白样品中，加入混合标准工作液0 μL、2.5 μL、5 μL、10 μL、20 μL、50 μL，分别以信号大于3倍和10倍信噪比作为定性和定量检测限。在5.00 g空白样品中加入混合标准溶液40 μL、120 μL和240 μL，测定3个添加水平的回收率及其变异系数（n＝6）。连续6 d，在5.00 g样品中添加120 μL混合标准工作液，计算其批间精密度（n＝6）。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

那西肽易溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等溶剂，微溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和苯，不溶于水。从以往文献报道来看，直接法提取动物源性食品和饲料中那西肽的常见的溶剂包括乙酸酸化的丙酮 ^[7]和含0.1%甲酸酸化的乙腈^[10,12]。间接法一般程序是由NaOH溶液水解成HMIA片段，通过阴离子交换固相萃取小柱MAX提取净化。也有学者采用正己烷去脂联合反相固相萃取小柱HLB进行净化^[12]。本方法同为间接法，但策略有所不同，先提取后水解。首先利用溶解度大的有机溶剂和正己烷双相提取，再经NaOH溶液进行加热水解，这样可以省去阴离子固相萃取的步骤，且能有效排除干扰物质，在大幅节约时间、提高样品通量的同时，也节省了检测成本。与酸化的丙酮和酸化乙腈提取相比较，本方法带来的极性杂质更少，见表1。

2.2 色谱条件和质谱条件的优化

首先，我们对色谱柱进行筛选。对T₃ HSS C₁₈和BEH C₁₈两款色谱柱进行比较。如图1所示，前者出峰时间大约2.8 min，后者保留时间在5.1 min，保留明显弱于后者，不仅如此，前者存在较强的干扰峰，以致基质中的离子比例（0.87）和实际离子比例（4.4）偏离很大，无法定性和定量。因此，选择了BEH C₁₈柱。

在流动相水-甲醇体系中，我们分别以乙酸铵（浓度2.5 mmol/L）和氨水（浓度为0.3%）作为流动相添加剂，比较两者在BEH C₁₈柱上的峰形和相应强度，后者的响应相对高于前者，峰形更好，故选择了氨水（浓度为0.3%）-甲醇作为流动相。

2.3 方法的有效性

2.3.1 选择性、线性和定量检测限

根据10个空白猪肉和10个空白鸡肉样品的分析发现，本方法能提供低背景且无明显干扰的质谱图，选择性好，见图1（d）。在线性范围内相关系数R均大于0.9960，定性检测限为2.5 μg/kg，定量检测限为5 μg/kg，低于日本规定最大残留限量30 μg/kg，见表1。

2.3.2 准确性和重复性

对于鸡肉：3个添加水平的平均回收率分别为94.4%～108.6%，相应的变异系数分别为3.9%～8.3%，批间变异系数为4.5%；对于猪肉：3个添加水平的平均回收率分别为92.1%～111.1%，相应的变异系数分别为3.0%～5.5%，批间变异系数为3.4%。两种基质的重复性和再现性的RSD均低于10%，精密度良好。鸡肉中3种那西肽添加回收率及其变异系数、日间精密度数据见表2。

2.4 实际应用

从宁波当地3家超市随机抽检12份鸡肉和15份猪肉，分析结果均显示为阴性。

3 结论

畜禽肉中那西肽，依次通过双相提取净化和碱水解能较好地排除基质干扰，并具有满意的灵敏度、准确度和精密度。与固相萃取等复杂费时的传统方法相比，本方法具有节约前处理方法时间和检测成本等特点，可满足畜禽肉中那西肽的高通量快速筛查与确证要求。

参考文献

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表1 与相关文献方法的比较

Table 1 Comparison with related literature methods

注: SPE为固相萃取小柱; D-SPE为分散固相萃取; MAX为阴离子交换固相萃取小柱

(a)和(b): T₃ HSS C₁₈且流动相为乙酸铵(2.5 mmol/L)-甲醇; (c)和(d): BEH C₁₈且流动相为氨水(0.3%)-甲醇; (a)和(c)为纯标准溶液图谱; (b)和(d)为猪肉中添加30 μg/kg那西肽的图谱

图1 不同色谱柱和流动相保留那西肽的色谱图

Fig.1 Chromatogram of nosiheptide with different columns and mobile phase

表2 鸡肉中3种那西肽添加回收率及其变异系数、日间精密度（n＝6）

Table 2 The average recoveries, coefficients of variation and inter-day precisions of 3 nasipeptides in chicken (n＝6)

注: L、M和H分别代表低、中、高3个水平

基金项目：福州海关科研项目（FK2021-17）

第一作者：刘正才（1977—），男，汉族，湖南湘潭人，硕士，正高级工程师，主要从事食品安全检测，E-mail: 54369174@qq.com

1. 福州海关技术中心检验检疫研究重点实验室 福州 350001

2. 国家鳗鱼加工技术研发分中心（福州），福建聚泉鳗鱼研究所 福州 350208

1. Fuzhou Customs Technical Center, Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fuzhou 350001

2. National Eel Processing Technology R&D Sub Centers(Fuzhou), Fujian Juquan Eel Institute, Fuzhou 350208