刘正才 陈舒奕 翁齐彪 倪祎森 林志栋 郑子威 林雨青

地西泮（Diazepam，C₁₆H₁₃ClN₂O）具有镇静、抗惊厥等作用，畜牧生产中经常被用作动物生长促进剂，以达到镇静催眠、促进生长和增重催肥的目的^[1]。 近年来，一些不法商贩擅自在水产动物捕捞和运输过程中非法使用地西泮^[2]，导致其在水产品中残留，人体长期摄入这类水产品会使中枢神经系统受到严重干扰^[3-5]。 因此，镇静剂类药物被许多国家列为水产动物捕捞和运输过程中的禁用药物。我国国家标准已明确规定在动物性食品中不得检出地西泮^[6]；《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》（农业部公告第176号）也规定严禁在饲料和动物饮用水中使用地西泮等精神类药物。根据近年来各省市市场监督管理局通报信息，草鱼、鲫鱼、鲤鱼、白鲢鱼等水产品中常有检出地西泮的情况，因此检测和监测水产品中地西泮具有重要意义。

基体标准物质在食品残留检测结果的准确性和可靠性方面起到至关重要的作用，国外残留分析实验室已普遍使用标准物质样品进行实验室质量控制和相关检测结果的评判，相关样品也已产业化^[7-9]。我国食品安全检测标准物质研发起步较晚，主要涉及重金属残留、食品添加剂、农兽药残留、食品毒素污染物等领域^[10-14]，但食品类标准物质与实际需求还有巨大缺口，尚未见含地西泮的草鱼基体标准物质研制的报道。本实验研制了一种以草鱼为基体的含地西泮的基质标准物质，可用于国内外水产品中地西泮残留检测过程中质量控制和方法验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（API4000 Qtrap，美国AB公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；电动肉丸机（YQ-6，中国佛山俊凌厨具电器厂）；stomacher3500型拍击均质器（英国Seward公司）；分析天平（德国Sartorius公司）；涡旋振荡器（德国IKA公司）；⁶⁰Co-γ-射线辐照装置（福建省康普顿公司）。

草鱼（长乐聚泉食品股份有限公司提供，约3 kg/条）。地西泮标准品（纯度≥99.9%），购于天津阿尔塔科技有限公司；同位素内标地西泮-D₅（纯度≥99.0%），购于美国Sigma 公司；乙腈、甲酸、冰乙酸均为色谱纯，购于德国Merck公司；包装材料：铝箔复合材料平口袋为外包装，PE平口袋作内袋。

1.2 标准物质的制备

将药浴后的草鱼样品集中捞出，去鳞、去骨后取肌肉，切成小块后进行组织匀浆：把草鱼肌肉搁置在匀浆机中，1000～4000 rpm的转速匀浆3～10 min，以4～5 kg/次的草鱼肌肉量搅拌2～4次；然后使用拍击式均质器100～200次/min的频率拍击3～10 min，更换拍击2～3次，制作成肉泥混合样2包，随机从2包中不同部位称取5份进行测试，进行均匀性试验的预试验，得出样品初步均匀后，将混合样冷冻干燥、研磨、过筛。将制得的样本装入铝箔包装袋中，每袋约5 g，用真空封口机进行热封口，贴上对应的标识，再以⁶⁰Co-γ-射线辐照灭菌，辐照剂量为12 kGy，灭菌后的样品置于-18℃冰柜冷冻保存。

1.3 均匀性与稳定性检验

随机抽取10份独立包装样品，取样量为0.25 g，以每个样品3次重复测试数据为一组，每种药物共10组30个数据，采用单因素方差分析法（F-检验）检验样品的均匀性。稳定性检验分为长期稳定性和短期稳定性，长期稳定性共进行12个月，每月取样2个，每个样品重复检测3次，以平均值作为检测结果；短期稳定性通过模拟样品运输条件，利用F-检验法对检测结果的均匀性进行评价。

1.4 定值及溯源性

参照标准JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》^[15]，采用同一种方法多家实验室联合定值的方式对标准物质进行定值。选择8家具有地西泮检测能力的实验室作为协同定值实验室，编号以D01～D08表示，每个实验室测得6个数据（3个样品2平行）。检测数据经夏皮洛-威尔克（Shapiro-Wilk）检验^[16]、柯克伦（Cochran）检验及格拉布斯（Grubbs）检验^[17]后取平均值进行定值。特性值不确定度U_CRM参照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）标准样品 定值的一般原则和统计方法》 ^[18]进行评估。通过有证地西泮标准样品溯源，以有证标准物质配制的标准溶液制作校准曲线，以保证溯源性。

1.5 样品的分析方法

1.5.1 样品前处理方法

参考SN/T 3235-2012《出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法 液相色谱-质谱法》检测样品中地西泮残留量，实验采用同位素内标法定量。

1.5.2 仪器条件

液相色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Poroshell SB C₁₈，1.8 μm/3.0×100 mm； 流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液-0.2 %甲酸，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～1 min，30% B，1～3 min，30% B～90% B，3～5 min，90% B维持不变，5～6 min，90% B～30%B；流速0.4 mL/min；柱温30℃；进样量 5 μL。

质谱条件：多反应监测（MRM）扫描模式；电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；电喷雾电压（IS）：5500 V；气帘气压力（CUR）：0.241 MPa（氮气）；离子源温度（TEM）：500℃；雾化气压力0.379 MPa；辅助气压力0.379 MPa。MRM质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 地西泮的药物代谢预试验

称取适量的地西泮片剂，用少量乙醇溶解，再用水稀释后分散均匀泼洒入池，使鱼池中添加地西泮浓度约为1 mg/L，静置过夜；选取约2 kg/条草鱼25尾放入池中，每天换1次水，用药3 d，3 d后每天取2条进行宰杀，检测鱼肉中地西泮的残留量，其结果如图1所示。从图中可以看出，鱼肉中的地西泮含量随时间的推移，先升高后趋于稳定，在7 d后浓度水平基本稳定，因此，阳性样本的采集时间选择在用药后7 d。

图1 草鱼肌肉组织中地西泮残留浓度随用药后时间的变化

Fig.1 Changes of diazepam residues in grass carp muscle tissues with time after drug application

2.2 样品的制备

根据预试验的结果重新进行草鱼的地西泮药浴实验，用药后第7天将采集的阳性肌肉样本用电动肉丸机制成糜样，然后用拍击均质器进行混匀。为了样品的保存和运输，试验将样品冷冻干燥至水分含量在3%以下，干燥后的样品用粉碎机粉碎后过35目孔筛。把研制好的样品用铝箔复合材料的双层包装袋进行真空包装后，对样品进行⁶⁰Co-γ辐照灭菌，置于低于-18℃条件下保存。

2.3 最小取样量的确定

为尽可能保持样品检测的原始性，该样本检测前需要加水进行复原。根据样品在冷冻脱水前后水分含量的测定，确定复水比例为1:7；考察了不同复水时间（10 min、20 min、30 min、40 min）对地西泮检测结果的影响，结果表明复水时间30 min后测得值最高。考察了不同取样量（0.1 g、0.25 g、0.5 g）的影响，地西泮测定平均结果与RSD（n＝3）分别为322 μg/kg（11.1%）、336 μg/kg（4.0%）、326 μg/kg（4.5%），对每个样品取0.25 g，按第1.3节所述进行均匀性测试评价，F＜F_0.05(9,20)，因此确定最小取样量为0.25 g。

2.4 均匀性研究

依据JJF 1343-2012的规定，从总样本中随机抽取10包，每包样品平行检测3次。对检测结果采用单因素方差分析法（F-检验）进行统计分析，方差分析结果见表2。方差分析结果表明F_地西泮＝1.926＜F_0.05(9,20)＝2.393，其P-value均大于0.05，表明显著水平α＝0.05时，其结果均未见显著差异，从而可以判定所研制的基体RM是均匀的。

2.5 稳定性研究

稳定性是生物类标准物质研制的最关键的指标，草鱼肌肉蛋白质和水分含量高，常温条件下很容易变质，本研究使用冷冻干燥技术得到含地西泮的草鱼粉，利于长期保存和运输，还可快速复溶，便于使用；在探索标准物质的保存方式时发现，辐照后地西泮残留浓度不会显著降低，因此，本研究使用⁶⁰Co-γ-射线辐照灭菌，辐照剂量为12 kGy，灭菌后的样品置于-18℃冰柜冷冻保存。同时也考察了模拟样品运输条件和极端条件的稳定性，将样本分别置于-18℃、4℃、室温、阳光下暴晒条件下（40℃）保存14 d后测定。另外，取独立包装样本邮寄海南往返，邮寄过去单程带有冰块，邮寄回来时处于自然环境中，考察短期稳定性。结果表明样本在暴晒的情况下，地西泮含量下降比较明显。对-18℃、常温以及邮寄条件下进行统计分析，首先，从外观上观察，样品均未出现膨胀、样品变质等不正常状态；检测数据采用F-检验表明：在显著水平α＝0.05时，F_地西泮＝0.7414＜F_crit（5.143），其结果均未见显著差异，从而可以判定所研制的自然基体标准物质在短期是稳定的，满足常温实际运输要求。

表2 草鱼肌肉中地西泮残留量的均匀性检测结果以及方差分析

Table 2 Analysis of homogeneity variance of diazepam residues in grass carp muscle

长期稳定性试验设计和计算过程参照标准GB 15000.3-2008中“8稳定性研究”进行，检测结果见表3，以均匀性检验为起点，稳定性8个月次的检测结果以时间-浓度进行线性拟合，并做回归分析。结果表明，在95%置信水平，地西泮Significance F＝0.60097＞0.05，表示回归是不显著的，因此确定基体RM在监测周期（12个月）内是稳定的。

2.6 定值与溯源

邀请了8所具有检测资质的机构进行协同定值，结果见表4。所得测量结果的正态分布使用夏皮洛-威尔克（Shapiro-wilk）检验，计算得W值为0.980＞W(48,0.95)＝0.947，所得数据符合正态分布；组内 可疑值的检验使用柯克伦（ Cochran ）检验，计算统计量 C 值。结果表明，统计量 C ＝ 0.313 ＜ 0.360 ＝ C ₀ (5%) ，说明所得数据结果无可疑值，均可参与后续检验；分别进行单值和双值格拉布斯检验，结果表明所得数据均无异常值。所有数据经评估合格后，计算总平均值作为标准值。

本研究选取的溯源路线是用有证标准物质内标法定量确定含量，通过有证标准物质溯源到基准单位。以有证标准物质配制标准溶液绘制校 准曲线，测量前对所有计量仪器（分析天平、容量瓶、移液枪等）进行校准，保证了结果的准确性和溯源性。

2.7 不确定度的评估

根据JJF 1343-2012的相关规定，标准物质特性值不确定度通过测定值标准不确定度（u_char）、均匀性不确定度（u_bb）、长期稳定性不确定度（u_lts）的合成并扩展来评定，合成不确定度为。k＝2时，相对扩展不确定度，最终的地西泮特性值为（324.2±30.2）μg/kg（k＝2）。

2.8 样品谱图

阳性样本按第1.5节所述进行处理后上机检测，得到离子监测色谱图，如图2所示，标准样品中地西泮在液相色谱串联质谱仪上获得良好的峰形和响应值。

图2 地西泮标准样品的选择离子监测色谱图

Fig.2 Selected ion chromatograms of diazepam RM samples preparation solution

3 结论

本实验通过给药浴方式获得含一定浓度地西泮残留量的阳性样本，经匀浆、冻干、分装、灭菌等步骤，制得一批草鱼肌肉粉中含地西泮自然基体标准样品。该样品均匀性和稳定性良好，地西泮特性值为（324.2±30.2）μg/kg（k＝2），可满足草鱼等水产品中地西泮检测过程中质量控制和方法验证的需求，确保检测结果的可靠性、可比性和溯源性，对提高不同实验室测量结果互认、提高水产品中违禁镇静剂类药物检测水平具有积极意义。

参考文献

[1] 邹叔骋, 王朝阳, 刘博, 等. 地西泮对胶质瘤术后睡眠障碍患者神经内分泌免疫因子表达水平的影响[J]. 中国医师杂志, 2018, 20(11): 1692-1694. 

[2] 王守英, 孔聪, 杨光昕, 等. 上海市售水产品地西泮及去甲地西泮残留调查分析[J]. 农产品质量与安全, 2020(3): 31-33.

[3] 李林艳, 徐建. 苯二氮类药物依赖及其防治[J]. 药物不良反应杂志, 2012(4): 228-230. 

[4] 宿书芳, 孙立臻, 薛霞, 等. 通过式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中地西泮[J]. 色谱, 2020, 38(7): 791-797. 

[5] 于慧娟, 钱蓓蕾, 黄冬梅, 等. 液相色谱串联质谱法测定大菱鲆和鳜鱼体中地西泮及其代谢物残留的研究[J]. 中国渔业质量与标准, 2011, 1(1): 54-59.

[6] GB 31650-2019食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量[S]. 北京: 中国农业出版社, 2020.

[7] 全浩, 韩永志. 标准物质及其应用技术第2版[M]. 北京: 中国标准出版社, 2002.

[8] Zakaria O, Rezali M F. Reference materials as a crucial tools for validation and verification of the analytical process [J]. Procedia-Social and Behavioral Sciences, 2014, 121(2): 204-213.

[9] 刘素丽, 王宏伟, 赵梅, 等. 食品中基体标准物质研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2019, 10(1): 8-13.

[10] 李梦怡 , 胡越 , 董喆 , 等. 大米粉中镉标准物质的研制[J]. 中国粮油学报, 2021, 36(8): 108-112.

[11] 时文春, 冯燕平, 李开锋, 等. 鱼肉中氯霉素标准样品的研制[J]. 分析测试学报, 2012, 31(10): 1339-1344.

[12] 安巧云, 魏敏, 周剑, 等. 乳粉中脂肪成分分析标准物质的研制[J]. 化学分析计量, 2021, 30(6): 6-10.

[13] 余孔捷, 刘正才, 黄杰, 等. 含喹诺酮类多残留鳗糜自然基体标准样品快速制备[J]. 分析试验室, 2015, 34(2): 182-185.

[14] 李梦怡 , 王宏伟, 董喆, 等. 猪肉粉中亚硝酸钠标准物质的研制[J]. 化学分析计量, 2022, 31(2): 1-6.

[15] JJF 1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理[S]. 北京: 中国质检出版社, 2012.

[16] GB/T 4882-2001 数据的统计处理和解释-正态性检验[S]. 北京:中国标准出版社, 2001.

[17] GB/T 6379.2-2004 测量方法与结果的准确度第2部分: 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法[S]. 北京:中国标准出版社, 2004.

[18] GB/T 15000.3-2008 标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法[S]. 北京:中国标准出版社, 2008.

表1 测定地西泮的主要质谱参数

Table 1 Major MS parameters for diazepam determination

注: *是指定量离子

表3 长期稳定性检测结果以及回归分析

Table 3 Results of long-term stability and regression analysis

表4 协同定值（n＝6）

Table 4 Cooperative setting values (n＝6)

m/z: 285.2＞193.0

m/z: 285.2＞154.1

第一作者：高洁（1984—），女，汉族，山东济宁人，硕士，高级工程师，主要从事食品检验工作，E-mail: gaoabai@163.com

1. 济宁海关技术中心 济宁 272000

2. 青岛海关 青岛 266001

1. Jining Customs Technical Centre, Jining 272000

2. Qingdao Customs, Qingdao 266001