张佳玮 任彤 马树宝 尹羿 赵相鹏 张小寒 杜思乐 汪琳

鲤鱼养殖及锦鲤观赏起源于3000年前的中国，鲤鱼作为中国主要的淡水经济鱼类之一，也是淡水鱼总产量最高的一种。锦鲤作为鲤的变种，拥有丰富的彩色形态，在我国观赏鱼行业也占据举足轻重的地位。鲤鱼和锦鲤作为具有重大市场价值的养殖对象，进出口贸易量不断增加。但鱼类货品中频繁检出锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）、鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）和鲤浮肿病毒（Carp edema virus，CEV）等鱼类疫病病原体。

1 鲤浮肿病研究背景

1.1 鲤浮肿病毒的介绍

鲤浮肿病毒属于痘病毒科鲤痘病毒，目前已知痘病毒科分有脊椎动物痘病毒亚科与昆虫痘病毒亚科2个亚科。目前，鲤浮肿病未明确其在痘病毒科的分类地位，但根据系统基因组学初步分析的数据，CEV应当属于痘病毒科的脊索动物门亚科^[1]。痘病毒可长时间存活于环境中，在适宜的条件下能感染新宿主^[2]。而对于鱼病领域，痘病毒科涉及的研究相对较少。

鲤浮肿病毒是一种大小为200～400 nm、有囊膜的富含A+T的双链DNA病毒，成熟的病毒体呈卵形或球形，具有大而复杂的基因组。Oyamatsu T^[3]在论文中提出该病毒的第一个部分序列，涉及2个核心蛋白基因，P4a和P4b。FTI 2020相关研究依托于P4a核心蛋白基因，根据CEV P4a基因片段遗传分析，将其分为3个基因型：基因型I和Ⅱb以及Ⅱa。其中，基因型I和Ⅱb感染普通鲤鱼，Ⅱa型感染普通鲤鱼和锦鲤。而最近波兰研究学者的研究表明，CEV基因型I和Ⅱb也可以感染锦鲤^[4]。在2021年4月，在锦鲤中分离出了CEV菌株FTI 2020的完整基因组序列^[5]。

1.2 鲤浮肿病的介绍

鲤浮肿病（Carp edema virus disease，CEVD）又称为锦鲤嗜睡病（Koi sleepy disease，KSD）^[6]。由于它和锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）在临床症状上非常相似，都是以烂鳃和眼凹为特征，这使人们在多年前误以为发病是由KHV所致，没有注意到CEV的存在^[7]。因此在养殖生产中，当鲤鱼或锦鲤出现烂鳃等症状且死亡率高发时，应同时进行KHV和CEV的PCR或qPCR检测，以确定病原。

1.2.1 临床症状

鲤鱼及锦鲤感染CEV病毒的明显特征为行动迟缓^[8]，聚居在栖息地边缘处或漂浮在水面上^[9]，呈沉睡状态。受到突然攻击或触摸时，病鱼才会短暂游动，但很快又继续处于昏睡状态^[10]。病鱼的实验室临床表现为烂鳃、鳃上黏液产生多（表现为苍白色，真菌样斑块）、皮下组织水肿所致的身体肿大、口腔及鳍根部溃疡、炎症严重等^[11-12]。伴随发生继发性感染，最终死于窒息。

1.2.2 镜检观察

在感染CEV的鲤或锦鲤中，最常见症状是鳃丝损害。通过透射电子显微镜在受感染鲤鱼的鳃上皮细胞中观察到类似于痘病毒的颗粒。低倍镜下，鳃组织上皮细胞的过度增殖导致鳃丝肿胀、充血；高倍镜下，观察到鳃细胞水肿、鳃小片相互融合以及上皮细胞脱落，且鳃丝之间存在脱落堆积的红细胞及炎性细胞^[13-14]。病鱼体内的病毒可能通过鳃进入水中从而感染其他宿主，这种方式的传播也更好地解释了CEV传播速度快的特性。2015年Lewisch^[12]对奥地利病例开展的易感性调查研究表明，鲤浮肿病可在6 h内发生传播，并可在3～7天内观察到感染的临床症状，在第8天出现典型临床症状，在8～17天之间到达死亡率峰值。

qPCR检测结果已证实，鳃组织CEV的病毒载量显著高于肾、脾、表皮和肠腔等组织，说明鳃组织是CEV增殖的最主要靶器官，但CEV拷贝量大小与临床症状严重程度、发病死亡情况并不成正比。在没有任何特殊临床症状的患病鱼的鱼鳃中也能检测出CEV的特异性DNA，表明CEV持续存在于患病鱼的鳃中，且可能随时被重新激活以引起感染，与鸡痘感染中所见的情况相同^[15]。

然而，由于对感染机制的了解尚不充足^[16]。迄今为止，CEV尚未在实验室中以细胞培养的方式进行繁殖，在细胞培养中从受感染的组织中重新分离CEV是一项挑战。

1.3 鲤浮肿病发现的历史脉络

鲤浮肿病毒最早于1974年在日本新泻的一个锦鲤养殖场中被发现并开展研究^[17]。在美国加州，CEV于1996年在锦鲤中被首次发现^[18]。英国、荷兰和德国分别于2009年、2013年和2014年首次报道了CEV^{[11, 19-20]}。中国于2015年在杭州首次发现感染CEV的鲤鱼^[14]，并相继发现不同基因型CEV的存在。自2015年，其他大部分国家也相继发布了关于CEV病毒感染的报道。

2 检测方法

根据Lewisch E^[12]的研究，CEV的广泛传播很可能归因于全球贸易中有效诊断和预防措施的缺乏。故建立灵敏、高效的病原检测技术是目前CEV疫病防控的有效手段之一，检测方法的准确性、及时性及其方法技术的更迭，对病原体的早发现早隔离起到关键性作用，从而避免更多的鱼群感染。

2.1 最佳的检测器官和组织

在使用光学显微镜和PCR技术对鱼进行检测时，建议对鳃组织进行采样。该病毒在鳃组织中含量最为丰富，相对于肾脏、脾脏、皮肤和肠道等其他器官，鳃组织具有统计学上更为显著的病毒载量^{[5, 21]}。

2.2 组织病理学手段

Swaminathan T R等^[21]和Pretto T等^[22]的组织病理学研究表明，对病鱼进行组织切片后，可以观察到鳃中的上皮细胞增生，其他组织未检查到明显的组织病理学改变。因此在口岸运输环节，对于未见临床症状的进出口鲤鱼样品可以通过易受感染器官鳃的组织病理学检测获得支持性证据，确定其是否存在明显症状，而后借助不同的分子技术进行进一步确认。

2.3 分子技术检测

Oyamatsu等^[23]设计的常规PCR检测方法，对基因组Ⅱa和Ⅱb的CEV阳性样品具有良好的检测效果。但在基因组Ⅰ的CEV阳性样本中，Oyamatsu等^[23]设计的引物会产生与预期产物大小相似的非特异性产物，即存在多个条带，从而难以解释其是否为阳性样本。多个条带的产生或许与引物与鲤鱼基因组的脱靶连接有关，设计引物不理想。因此，为了提高检测的可靠性及准确度，其他专家为常规PCR和qPCR分析的特异性检测设计了新的引物组。

汉诺威兽医大学（TiHo）Adamek等人^[24]建立了定量（探针）PCR检测和SYBRGreen定量PCR检测方法。TiHo qPCR的诊断可用性仅限于从基因组Ⅱa和Ⅱb中检测CEV。而对于大多数基因组Ⅰ的阳性样品，TiHo qPCR检测方法囊括的目的基因较长，非特异性基因较多，Ct值明显高于用其他方法检测的Ct值，使得弱阳性呈现阴性结果，灵敏度低。基因组Ⅰ在检测上也具有Oyamatsu等^[9]设计的常规PCR检测方法的局促性，检测过程不能囊括所有阳性样品。而TiHo SYBRGreen qPCR检测方法在经过改良后显著提高了对于基因组Ⅰ以及来自基因组Ⅱa和Ⅱb的CEV感染样品的分析包容性和诊断灵敏度。

随后，英国韦茅斯的环境、渔业和水产养殖科学中心（CEFAS）的Adamek等^[25-26]制定了CEFAS常规PCR检测方法与定量（探针）PCR检测方法。其中qPCR方法和传统的套式PCR方法具有相近的检测灵敏度及准确性，其组织检出限为1～10 copies/mg或4～40 copies/mg。曹欢等^[27]建立了CEV的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，检出限为6 copies/µL，具有较高的特异性及检测灵敏度。吕晓楠等^[28]建立了CEV的重组酶等温扩增技术（Recombinase aided amp，RAA）与侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick，LFD）相结合的一种RAA-LFD快速检测技术，该方法的最低检出限与PCR检测方法的最低检出限接近，是一种快速、准确的原位检测技术，具有较高的时效性。

在我国水产行业标准SC/T 7229-2019《鲤浮肿病诊断规程》中，鲤浮肿病的诊断运用了Oyamatsu等^[9]设计的引物、CEFAS设计的引物序列以及曹欢等^[27]建立的LAMP技术。同样，吉林省地方标准DB22/T 3194-2020《鲤浮肿病防疫技术规范》也运用了Oyamatsu等^[9]设计的引物以及CEFAS设计的引物序列。

3 预防和治疗手段

为防止病原体进入种群，新鱼应在恒定水温（即20～25^oC）中，于单独的区域保持至少30天，并且在喂食和日常维护时也需要小心。进一步的预防措施包括保持鱼类健康、提供优质水和饲料、减少过度拥挤和压力状况。

目前，CEV没有治疗方法，但研究表明，将感染CEV的鲤鱼浸泡在浓度为0.5%（严重时最高限度为3%）的盐水中可降低其死亡率。虽然使用盐水浸泡处理CEVD病鱼可以降低死亡率和传染率，但这并不能完全消灭CEV病毒，而且目前尚不清楚CEVD感染的幸存者是否会终生携带病毒，因此建议不要将幸存者与其他健康鱼一同饲养。

4 目前研究的挑战及方向

鲤浮肿病是鲤鱼中存在的较新的疾病，仍然存在许多未知信息。例如：在宿主外存活的机制及病毒感染宿主的机制。以CEV为代表的痘病毒，通常通过鱼个体之间的直接接触进行传播，对于它是否会以受污染的材料/物质或者节肢动物为载体（鱼虱）传播，以及目前在鲤鱼种群中流行率是否变化，都需要进行长期观察。除鲤鱼外，CEV是否会感染其他鲤科动物，或者虽不感染其他鱼类，但其他鱼类是否会作为病毒携带者进行病毒传播，同样是今后的研究方向之一。Matras M等^[26]在实验性传播研究报告中提出，CEV存在从受感染的鲤鱼到鲤科鲫鱼、欧洲鲈鱼、丁鱼等传播的可能性，不过此观点还需要进行考证。

目前，确定病毒特征、CEV诱导的免疫反应和其他分子研究的主要障碍是缺乏合适的细胞系来进行检测和病毒分离。部分专家学者已尝试利用黑头鲦鱼（FHM）、锦鲤鱼鳍（CCKF）、珍珠斑鳍（PSF）、卡托普拉鱼鳍（CCF）、鲤鱼脑（CCB）等多种硬骨细胞系进行CEV分离，但均未从上述细胞系中检测到细胞病变效应（CPF），也无法分离得到病毒，这一难题阻碍了分子和病毒学研究的进程。

目前，淡水和海洋鱼类在超过125个国家进行贸易，在同时引入多批进口鱼时，在流通过程中存在交叉感染风险。世界范围内野生及水产养殖鱼类种群死亡的主要原因之一便是传染疾病的入侵，其主要途径来源于人为易位^[29]。同时也存在其他原因，例如：受全球气候影响，野生鱼类迁移到新的地理区域或跨越天然屏障进入新的栖息地；人为参与，放生异地种群鱼，走私非本土鱼等，将看似健康但本身携带病毒的鱼类进行人为扩散，这些都可能造成本土鱼类的毁灭性死亡。因此建立有效的监测系统和开发高度特异性的诊断方法以有效控制CEV的暴发，是今后研究的挑战及方向。

5 结论

鲤浮肿病作为鲤鱼及锦鲤的新型传染病，其出现的时间进程较近，在我国发现时间较晚，截至目前还不足10年。鲤浮肿病的发病机制等尚未可知，流行率未知，其极大的未知变量亟待解决。作为被列入国家水生动物疫病监测计划内的病种，我们对它的研究目前还在进行中，该病具有许多未知的可能性，需引起监测者、检测者和相关水生法规立法者的高度重视。研究人员应继续投入到该病的基础性研究中，建立敏感细胞系，探索CEV的耐受鱼群，对鱼群的耐受机制进行研究，为进一步研制出CEV特效药物及疫苗作出贡献。

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基金项目：海关总署科研项目（2021HK007）；“十四五”国家重点研发计划项目（2022SWAQ0100）

第一作者：张佳玮（1998—），女，汉族，江西南昌人，本科，助理兽医师，主要研究方向为动物医学，E-mail: geo5082@163.com

通信作者：汪琳（1974—），女，汉族，湖北随州人，博士，研究员，主要研究方向为动物医学，E-mail: 15301090661@189.com

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

2. 北京海关 北京 100026

1. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

2. Beijing Customs, Beijing 100026

表1 涉及的引物及探针序列

Table 1 Primer and probe sequences involved