吕晓玲 段维军 赵秀玲 崔俊霞 康立 于纪棉

基金项目：宁波市自然科学基金（202003N4179），宁波市自然科学基金（2019A610233）

第一作者：吕晓玲（1984—），女，汉族，河南信阳人，硕士，农艺师，主要从事植物检疫工作，E-mail: lxling817@sina.com

1. 宁波海关技术中心 宁波 315100

2. 宁波检验检疫科学研究院 宁波 315100

3. 宁波卫生职业技术学院 宁波 315100

1. Ningbo Customs Technology Center, Ningbo 315100

2. Ningbo Quarantine & Inspection Science and Technology Academy, Ningbo 315100

3. Ningbo College of Health Sciences, Ningbo 315100

船舶压载水（也称“压舱水”）是指在船舶航行过程中，为增加吃水、改变纵倾、调节稳定性，而在船上加装的水^[1]。压载水中含有细菌、病毒、藻类、浮游动物以及卵、孢囊等各类幼体，其中，生物种类可达7000种。每年约有百亿吨压载水携带大量的浮游生物随着船舶在全球范围内转移，将入侵海洋物种引入新环境，这对压载水排放地的生态、经济和人类健康构成巨大威胁，被视为海洋四大危害之一^[2-3]。我国沿海港口分布密集，据估算，每年压载水的输入总量可达数亿吨^[4-5]。

为了控制与管理船舶压载水和沉积物排放，减少有害水生生物对生态环境以及人类健康带来的威胁，2004年，国际海事组织（IMO）制定了《压载水公约》，要求各缔约国对压载水进行处理。在附则D-2部分规定了允许排放的压载水中活体生物限量^[1,6]，如表1所示。《压载水公约》于2017年9月8日正式实施，并于2019年1月22日对我国正式生效。根据公约要求，中国需开展港口国监督（Port State Control，PSC）检查，并监测压载水处理的效果。2021年生效的《中华人民共和国生物安全法》第二十三条明确规定“国际航行船舶压舱水排放等应符合我国生物安全管理要求”。为此，我国加快了压载水处理系统、浮游生物快速检测等关键技术的研发和相关标准的制定工作。本文主要针对压载水中浮游生物的检测现状进行梳理总结，介绍了当前压载水检测的主要方法及特点，并提出了压载水浮游生物快速检测的建议。

表1 压载水排放D-2标准

Table 1 D-2 standard for ballast water

1 基于形态学的检测方法

1.1 显微镜观察法

运用光学显微镜对浮游植物进行观察分析是当前鉴别和计量浮游植物最直接和可信的方法，是浮游植物分类鉴定的基础^[7-8]。显微镜观察法是一种传统的浮游植物检测分析方法，目前主要包括普通显微镜观察计数法和双荧光染色法。

取一定量的样品加入浮游生物计数框内，直接在高倍显微镜下观察，通过细胞完整度、色素降解情况等形态学特征进行计数和种类鉴定^[9]，可添加鲁哥氏液或甲醛固定，以方便观察。

杨清良等^[10]采用显微镜观察法对2006—2008年间采自东南沿海有关港口17艘船舶的外轮压载水的各类生物的物种组成、丰度进行研究，检出分属于7个浮游植物门类87属257种外来压载水藻类（含变种和60种赤潮生物）。叶海新等^[11]对来自中国近海海域的船舶压载水进行分析，在6艘船舶压载水样品中共采集到浮游植物22种，其中硅藻门17种、甲藻门4种、金藻门1种，优势种为硅藻。

采用直接计数法对浮游生物进行检测时，不仅需要分辨率较高的显微镜，而且要求检测人员具有丰富的经验，否则在一些情况下，很难通过细胞形态特征来准确辨别细胞活性，因此，检测人员可以对细胞进行染色来辅助鉴定。常用的染色剂有中性红染料、Sytox、荧光素二乙酸酯（FDA）和5-氯甲基荧光素二醋酸酯（CMFDA）等。采用双荧光（FDA-CMFDA）染色法，浮游生物活细胞可以产生较强的荧光信号，从而实现对样品中活细胞的精确定量。目前，双荧光染色因使用剂量低、染色时间短，成为美国环境保护署（EPA）的建议方法^[12]。

显微镜观察法能够直接快速鉴定形态特征明显、有参考图谱的浮游生物，但受显微镜放大倍数的限制，对于微型浮游生物（尺寸小于10 μm）的检测则非常困难，常导致微型浮游生物的漏检。但因显微镜具有计数法观测范围广、鉴定速度快、准确度高等特点，目前仍然是国际上浮游生物种类鉴定最通用的方法。

1.2 流式细胞术

流式细胞术（Flow cytometey，FCM）出现于20世纪70年代，用于对悬浮在流体中的微小颗粒进行计数和分选，最早应用于医学领域的样本检测中。它能快速分析上万个细胞，并同时从一个细胞中测得多个参数，根据这些特征参数对细胞群体进行分选，因此成为当代最先进的细胞定量分析技术。发展到80年代，FCM被应用于海洋生物学研究领域，为分析海洋浮游生物群落，特别是微型浮游植物、海洋细菌鉴定提供了一种有用的工具^[13-14]。

国内外陆续有学者开始研究流式细胞术并用于检测水体中的浮游生物。张利华等^[14]利用FCM对东海、黄海水域中微型浮游植物进行了识别测量的初步探讨，直接利用浮游生物的自发荧光对3种不同类群的微型浮游生物亚群进行辨别，成功实现了对微型浮游植物的鉴定，拓展了FCM在淡水微型生物和环境生物学中的应用。随着流式细胞仪的研发，结合细胞染色技术，FCM被用于测量压载水样品中的生物活体数量^[15-17]。Joachimsthal等^[15]采用FCM分析了船舶压载水，结果表明FCM不仅能够检测压载水中不可存活的浮游生物，还可以检测那些存活的但不能人工培养的微生物，且检测误差远低于培养过程和荧光分析所产生的误差。

根据《压载水公约》D-2标准要求，尺寸大于等于10 μm且小于50 μm浮游生物的浓度不超过10 个/mL，为确保测量结果的准确性，需要检测大体积的水样。而流式细胞仪在样品分析时，进样量较小，所以当样品中细胞浓度低于10³ 个/mL时需要配合浓缩手段，该操作增加了时间成本，也成为限制FCM在压载水检测中应用的最主要因素^[18]。

1.3 流式细胞成像

流式细胞成像法（Flow cytometry and micros cope，Flow CAM）是近年来发展起来的一种将流式细胞技术、显微成像技术与图像识别技术结合的新型颗粒分析方法，通过软件自动整理每个颗粒的图像，以实现智能化检测。Flow CAM可以对样品中的细胞等颗粒物进行捕捉拍摄，并将拍摄到的颗粒物图像进行在线显示^[19]。近年来，随着人工智能识别技术的发展，Flow CAM逐渐应用在浮游生物检测领域^[20-21]。根据样品中浮游生物的形态学差异，借助软件自动整理并分析每个生物颗粒的图像，经图库比对后实现对浮游生物的自动识别和种类计数，适用于大量样品的监测分析。

Flow CAM以智能拍摄系统取代人工，在流式细胞仪检测的基础上有了进一步提高。在实际应用中，由于浮游生物种类非常丰富，包括各种形态不同的类群，同时水体中还存在沉积物颗粒等各种非生物体，而Flow CAM获得的照片分辨率有限，运动中的样品颗粒也会导致一定程度的模糊，所以在样品种类准确鉴定方面存在一定局限性^[22]。加之一些相似属或种间的细胞形态学差异很小，因此需要不断补充完善浮游生物图谱数据库，以提高自动识别的准确率。

基于生物细胞形态特征与计算机技术结合的图像识别法是当前快速鉴定分类的趋势，它适用于压载水中浮游生物的检测，实现大量样品的快速分析。骆巧琦^[23]针对浮游植物自动识别关键技术进行研究，建立了一套包括我国沿海常见浮游植物种类的分类信息、生态信息、显微图片等数据的浮游植物种类电子数据库，为显微自动识别技术提供了丰富数据。高亚辉等^[24]建立了一套浮游植物的特征数据库，并利用显微镜扫描系统和计算机开发了一套浮游植物的自动识别鉴定系统。随着以数字全息技术为代表的三维成像方法与以卷积神经网络（Convolutional Neural Network，CNN）为代表的智能图像处理算法的快速发展，高智能化程度的Flow CAM在压载水的快速检测领域具有广阔的应用前景^[25]。

2 基于分子生物学的检测方法

2.1 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。自1985年由Mullis等发明该技术以来，它已成为分子生物学研究中最常用的技术和方法^[26]。随着PCR检测技术日趋完善，藻类等浮游生物的检测已经进入基因测序分析的分子生物学水平。

在藻类等浮游植物的研究中，研究者利用PCR技术扩增某些基因片段（如核糖体DNA）以达到分析亲缘关系、鉴定物种的目的^[27]。Stehouser^[28]采用正向引物CYA359F-GC，反向引物CYA781R(a)和CYA781R(b)进行扩增，对压载水中的藻类进行检测，检出了显微镜观察法未能识别的有毒拟菱形藻（Pseudo nitzschia spp.）。与传统的核酸分子克隆相比，PCR方法的优势在于能快速制备足够分析的DNA量，进行微量或小模板的扩增，且对样品的要求不高，尤其可以对环境样品进行扩增。但常规PCR技术有许多局限性，如不能对检测目标进行定量检测，无法鉴定细胞的活性，并且相较于显微镜直接观察法，DNA提取耗费时间长、成本高。分子生物学技术更适合于形态特征差异小或者未知种类的微型藻鉴定研究。

2.2 实时荧光PCR检测技术

除PCR方法外，实时荧光定量PCR技术^[29]、核酸探针技术^[30]也得到了一定程度的应用。近年来，该技术已广泛应用于藻类的检测研究中，Bowers等^[31]利用基于TaqMan探针的荧光PCR方法，针对Pfiesteria piscicida的18S rDNA设计了特异性引物与探针，实现了对该藻的快速检测。何闪英等^[32]针对中肋骨条藻内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer，ITS）片段设计了特异性引物和探针，成功建立了中肋骨条藻的实时荧光PCR检测方法。此外，实时荧光PCR技术也成功应用于圆海链藻、赤潮异弯藻、红色裸甲藻、亚历山大藻等重要赤潮藻类的快速检测鉴定^[33-34]。唐晨^[35]利用藻蓝蛋白基因PC及ropC1等作为目标检测片段，建立了一整套成熟的微囊藻多重PCR和荧光定量PCR检测方法。实时荧光PCR的检测方法具有灵敏性高、特异性强和精确性高等特点，但同样存在核酸提取、检测过程繁琐，检测结果干扰因素多等缺点。

2.3 高通量测序技术

高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指一次性对几十万至几百万条DNA分子进行序列测定的技术，又被称为大规模平行测序（Massively parallel sequencing，MPS）或“下一代”测序技术（Next-generation sequencing，NGS）^[36]。随着该技术在生命科学领域的广泛应用及测序成本的下降，其高通量、自动化及灵敏度高等特征使其广泛应用于生态、环境等样品的检测分析中^[37-39]。

与传统研究方法相比，高通量测序技术以压载水中浮游植物群体基因组为研究对象，在分析生物多样性、种群结构、进化关系的研究中，避免了大部分海洋藻类无法培养或者痕量样品无法检测的问题，同时可以较好地鉴定直径小于10 µm的微藻及孢囊。通过采用适当的分子条形码，且进行足够深度的测序，高通量测序技术可以获得比常规分析方法更多的物种信息。Darling等^[40]采用了基于18S rDNA位点的高通量测序，来评估从美国太平洋沿岸的多个港口输送到瓦尔迪兹的压载水相关的生物群落，并对经过公海置换后的压载水中原生生物和后生群落进行评估。胡章喜等^[41]采用高通量测序技术对船舶压载水中沉积物的有害藻华孢囊进行了研究，在鉴定出的73种甲藻中，有23种此前未报道过能产生孢囊，9种直径小于15 µm，56种首次在压舱底泥中报道。刘宇洋^[42]结合普通PCR、荧光原位杂交和单细胞PCR技术，对海洋沉积物中3种休眠孢囊进行检测。在28S rDNA的D2区分别设计了米氏凯伦藻、东海原甲藻、剧毒卡尔藻的特异性引物，在曾经爆发过赤潮的区域或附近提取沉积物样品的宏DNA，经过普通PCR及其产物的克隆测序，确定沉积物中存在这3种甲藻的核酸信号。

在高通量测序的基础上，根据获得的序列信息，对重要的海洋浮游植物种类（产毒素的、种类不确定的、未描述过的种/属），如裸甲藻属、亚历山大藻等设计特异性分子探针和引物，应用克隆测序的手段，可以实现准确鉴定。而对于现阶段尚不能完全准确鉴定的种类，所获得的特征基因序列数据将为以后入侵藻类的溯源和港口生物多样性研究提供重要的数据资源。因此，高通量测序技术在压载水及沉积物中的未知藻类监测与风险评估中具有巨大的应用前景。

3 研究展望

总体来说，由于我国对压载水中可存活生物的检测研究起步较晚，国内目前仍缺少相关的检测标准与方法，IMO也未对压载水中浮游生物的检测标准进行明确的规定。这对我国入境船舶压载水排放监管，防范外来有毒有害藻类和海洋生物入侵，保护近海海洋生态安全等工作带来较大的阻碍。

压载水中的可存活生物检测是评估压载水危害以及压载水处理工艺效率的前提和基础，如何较为准确并快速地检测出压载水中的活体生物数量，是今后研究的重点方向。Steinberg等^[43]评估了几种常用的计数浮游植物的方法：膜过滤器直接计数法、流式细胞术和流式细胞成像系统（Flow CAM），结果表明几种计数方法都能够估算细胞浓度，并可使用荧光探针确定细胞活力。几种方法均适用于监测排放的压载水，因此，辅助因素（如分析的容易程度、样本处理速度、样本大小等）是选择最佳浮游植物计数方法的关键因素。

基于形态学的显微镜观察法可以直观地检测浮游植物种类及活性，但对检测人员的专业度要求非常高，同时，在样品中的杂质干扰下准确鉴定浮游植物种类也是一个难题。应用分子生物学手段，可以得到更准确的浮游生物名录，尤其是大量未被研究、描述过的种类^[44]。由于D-2标准对压载水中浮游生物的排放指标为其是否可存活，但分子生物学手段无法判断检测到的核酸信息是否来自死细胞，故其不适用于D-2标准的检测要求。分子生物学技术更加适用于特定藻类的研究，如有毒藻类的鉴定。基于准确、快速、自动程度高等特点，流式细胞成像法在港口压载水可存活生物的快速检测中具有显著优势，但高风险有毒藻类数据库有待进一步完善，精确度仍需进一步提高^[45]。

由于公海置换后的压载水中可存活生物的浓度非常低，在不影响细胞形态的情况下如何对压载水样本进行快速浓缩过滤、如何进一步提升对低浓度样本的检测能力以及口岸便携化检测设备的研制，都是今后研究的重要方向。压载水中浮游植物检测的各种方法均存在自身的优势与局限，如何将几种方法结合使用，开发更为经济、便捷的设备，以实现港口压载水的快速、准确检测，帮助口岸执法人员对压载水是否符合D-2排放标准进行判断，也是今后研究的一大趋势。

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