李金庆 阮国栋 孙铭璐 徐娟 王克霞 曲直 邹强 段效辉

Abstract Grapevine leafroll-associated virus 3 is considered to be the most important pathogenic factor of grape leafroll disease. In this study, two pairs of forward and reverse primers and a TaqMan probe were designed and synthesized according to the conserved region of the RNA-dependent RNA polymerase gene sequence of Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) in NCBI nucleic acid database. Based on the comparison of specificity, sensitivity and amplification efficiency of fluorescent PCR, according to two sets of primer sequences and the same TaqMan probe sequence, a new method for real-time fluorescent RT-PCR detection of GLRaV-3 with double primers and one probe was established using the reverse transcriptional cDNA of viral RNA as the template. The detection limit of the method for total viral RNA was up to 4.5 fg/μL. With the two combinations mutually verified and non-specific amplification reduced, the specificity of the method has been further improved.

Keywords real-time fluorescent RT-PCR with double primers and one probe; grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3); detection

我国是世界葡萄生产大国，据国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）发布的数据显示，截至2021年，我国葡萄栽培面积达到78.3万hm²，位居世界第3位^[1]，是我国重要的经济果树。葡萄病毒病是制约葡萄产业健康发展的主要因素，截至目前，已报道感染葡萄的病毒及类病毒种类大约70种^[2]。其中，葡萄卷叶病是葡萄种植业不容忽视的病害。该病能够抑制葡萄的生长发育、降低光合作用与生理代谢、导致产量与品质下降，影响葡萄酒品质^[3]，在世界范围内葡萄产地均造成严重危害。引起葡萄卷叶病的葡萄卷叶病毒（Grapevine leafroll-associated virus，GLRaV）可达十余种，其中，葡萄卷叶病毒3（Grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）被认为是危害最大的一种，发生普遍、危害严重。

GLRaV-3属于长线性病毒科Closteroviridae，葡萄卷叶病毒属Ampeloviru^[4]。目前报道的GLRaV-3的检测方法，有指示植物法^[5-6]、酶联免疫吸附法^[7]、电镜观察法^[8]、免疫捕捉 PCR^[9]、环介导等温扩增技术^[10]、实时荧光PCR ^[11-12]等，在实际操作中还存在特异性不强、操作复杂等局限性，需要进一步提升方法的特异性与准确性，简化操作流程。本研究通过实验建立了双引物一条探针实时荧光RT-PCR检测GLRaV-3的新方法，该方法可形成2套独立的荧光PCR检测体系，通过2套检测体系的相互验证，有效提高方法的特异性和灵敏度。

1 材料与方法

1.1 材料来源

葡萄卷叶病毒3（GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘伴随病毒（GRSPaV）、葡萄病毒E（GVE）、葡萄卷叶病毒1（GLRaV-1）、葡萄卷叶病毒2（GLRaV-2）均由烟台海关技术中心保存，番茄黑环病毒（TBRV）、草莓潜环斑病毒（SLRSV）由中国检科院植物检验与检疫研究所赠送。

1.2 主要试剂与设备

植物总RNA提取试剂盒（DP432）、FastFire快速定量PCR试剂（探针法）（FP208）、FastKing 一步法除基因组 cDNA 第一链合成预混试剂（KR118）均购自天根生化科技（北京）有限公司；实时荧光PCR仪ABI QuantStudio 6（美国ABI公司）；普通PCR扩增仪T100（美国Bio-Rad公司）；高速冷冻离心机5417R（德国Eppendorf公司）；涡旋混匀仪TGyrate mini（中国天根生化）；核酸蛋白分析仪BioPhotometer Plus（德国Eppendorf公司）。

1.3 引物与探针的设计

分析NCBI核酸数据库中GLRaV-3的RNA复制酶基因（RNA-dependent RNA polymerase gene (RdRp)）序列保守区，利用Beacon Designer 8软件分别设计特异性检测GLRaV-3的3条引物和一条TaqMan探针，组成2套不同的反应组合：套1和套2。其中一条上游引物为2套组合共有，上游引物GLRaV-3F：5'-TTTACTGCGTGCGTAGAGCG-3'。下游引物用GLRaV-3R表示，其中GLRaV-3R1：5'-GGTGTAGTATTGCCGGATGTCC-3'。GLRaV-3R2：5'-CCCAAATTGTTCCTCAATGCA-3'；探针序列GLRaV-3P：5'-FAM-GCTCTTCTACCACGGGATGG ACACTGC-BHQ1-3'。套1用GLRaV-3F/GLRaV-3R1/GLRaV-3P表示，套2用GLRaV-3F/GLRaV-3R2/GLRaV-3P表示。套1对应的PCR产物长度为129 bp，套2对应的PCR产物长度为107 bp。引物和探针由擎科生物合成。

1.4 病毒总RNA提取

采用植物总RNA提取试剂盒DP432试剂盒提取病毒及对照叶片中的病毒总RNA，提取的病毒总RNA用核酸蛋白分析仪测定浓度、纯度，-80℃保存备用。

1.5 cDNA合成

病毒总RNA及阴性对照采用天根生化反转录预混试剂KR118在PCR仪T100上分别进行反转录合成cDNA。反应体系：5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，总RNA 4 μL，加ddH₂O至20 μL。反应条件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。-20℃保存备用。

1.6 双引物一条探针的实时荧光PCR检测

1.6.1 特异性试验

分别以1.1材料中各种病毒的cDNA及阴性对照（健康叶片及ddH₂O）为模板，在实时荧光PCR仪ABI QuantStudio 6上进行荧光PCR特异性检测。反应体系：2×FastFire qPCR PreMix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL，下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，探针（10 μmol/L）0.6 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2.0 μL, 加ddH₂O补足至20 μL。反应条件：95℃ 1 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45个循环。

1.6.2 灵敏度试验

将提取的葡萄卷叶病毒3总RNA，进行10倍梯度稀释，稀释至10^-9，加上ddH₂O共10个梯度，分别进行cDNA合成及实时荧光PCR灵敏度检测，反应体系和反应条件参照1.5、1.6.1。

1.6.3 套1和套2组合的扩增效率对比试验

采用葡萄卷叶病毒3同一cDNA为模板，分别用套1和套2的引物探针进行实时荧光PCR检测，比较套1和套2组合的扩增效率情况。实时荧光PCR操作参照1.6.1。

2 结果分析

2.1 特异性验证结果

2套组合的特异性验证结果分别见图1、图2。由两图可知，每套组合GLRaV-3的cDNA均出现特异性扩增曲线，套1的Ct值为14.98，套2的Ct值为15.21，而其他6种病毒和2种阴性对照的cDNA均未出现扩增信号，说明两套组合荧光PCR扩增的特异性很好，符合检测方法要求。

2.2 灵敏度验证结果

2套组合的灵敏度验证结果分别见图3、图4。由图可知，当RNA稀释至10^-8（即0.45 fg/μL）时，扩增曲线接近水平线，而10^-1～10^-7稀释度都能产生典型的扩增曲线，套1的Ct值梯度分别是19.53、23.09、27.09、29.38、32.14、34.75、36.21，套2 的Ct值梯度分别是19.05、23.10、27.36、29.40、32.46、34.80、36.13。结果显示，病毒总RNA含量达4.5 fg/μL时，该方法即可检出该病毒。

2.3 套1和套2扩增效率对比试验结果

本研究建立的2套组合的引物探针扩增效率对比试验结果见图5。由图可知，2套组合的扩增曲线近乎平行，扩增效率几乎等同，Ct值分别为16.45和16.28，都有较高的扩增效率，可以进行相互验证，提高结果准确度。

3 结论

近年来，国内进口葡萄苗木越来越多，以山东口岸为例，2013—2015年每年进境葡萄苗木分别为11.8万株、25.2万株和6万株。随着进境葡萄苗木的增加，传带植物病毒的检疫风险极高。山东口岸就曾在进境葡萄苗中截获过葡萄卷叶病毒3。在实际检测工作中发现，进境苗木中大多携带极微量的病毒3，由于EILSA技术和普通PCR方法达不到其所要求的检测灵敏度，极易造成漏检^[13-14]。

双引物一条探针的实时荧光RT-PCR技术以实时荧光PCR技术为基础，在保证实时荧光PCR的简便、快速和高灵敏度特性的同时，增加一条引物，即可形成2套独立的荧光PCR检测体系，通过2套组合相互验证，进一步提高特异性，减少非特异性扩增。当病毒含量较低、而使用灵敏度差异较大的2种检测方法（如实时荧光PCR法与PCR凝胶电泳方法）相互验证进行检测时，检测结果判定会相互干扰，使得检测的准确性大大降低。而本文研制的检测方法由于2套检测组合的灵敏度较接近，减少了漏检情况，检测准确性得到有效提升，满足了目标病毒含量较低的样本中葡萄卷叶病毒3的检测需求。本方法的建立证明了双引物一条探针实时荧光RT-PCR技术适用于葡萄卷叶病毒3的检测，方法特异性强，检测灵敏度高，有效提高葡萄卷叶病毒3检测结果的准确性，可在口岸进境葡萄苗检疫及病毒普查等工作中发挥作用，促进葡萄产业的良性发展。

参考文献

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A: GLRaV-3; B: TBRV; C: SLRSV; D: GRSPaV; E: GVE; F: GLRaV-1; G: GLRaV-2; H: 健康叶(CK1); I: ddH₂O (CK2)

图1 套1（GLRaV-3F/GLRaV-3R1/GLRaV-3P）引物探针荧光PCR特异性扩增实验结果

Fig.1 Specificity of fluorescent PCR amplification for set 1 (GLRaV-3F/GLRaV-3R1/GLRaV-3P) primer-probe

A: GLRaV-3; B: TBRV; C: SLRSV; D: GRSPaV; E: GVE; F: GLRaV-1; G: GLRaV-2; H: 健康叶(CK1); I: ddH₂O (CK2)

图2 套2（GLRaV-3F/GLRaV-3R2/GLRaV-3P）引物探针荧光PCR特异性扩增实验结果

Fig.2 Specificity of fluorescent PCR amplification for set 2 (GLRaV-3F/GLRaV-3R2/GLRaV-3P) primer-probe

A: 4.5 ng/μL; B: 450 pg/μL; C: 45 pg/μL; D: 4.5 pg/μL; E: 450 fg/μL; F: 45 fg/μL; G: 4.5 fg/μL; H: 0.45 fg/μL; I: 0.045 fg/μL; J: ddH₂O

图3 套1（GLRaV-3F/GLRaV-3R1/GLRaV-3P）引物探针荧光PCR灵敏度实验结果

Fig.3 Sensitivity of fluorescent PCR amplification for set 1 (GLRaV-3F/GLRaV-3R1/GLRaV-3P) primer-probe

A: 4.5 ng/μL; B: 450 pg/μL; C: 45 pg/μL; D: 4.5 pg/μL; E: 450 fg/μL; F: 45 fg/μL; G: 4.5 fg/μL; H: 0.45 fg/μL; I: 0.045 fg/μL; J: ddH₂O

图4 套2（GLRaV-3F/GLRaV-3R2/GLRaV-3P）引物探针荧光PCR灵敏度实验结果

Fig.4 Sensitivity of fluorescent PCR amplification for set 2 (GLRaV-3F/GLRaV-3R2/GLRaV-3P) primer-probe

A: 套1组合; B: 套2组合

图5 套1组合和套2组合引物探针荧光PCR扩增效率结果对比图

Fig.5 Efficiency of fluorescent PCR amplification for primer-probe set 1 and set 2