苏小建 陶莉 杨国平 吴旭东 封振 田雯 耿合员 杨庆贵

基金项目：海关总署科研项目（2020HK132），南京海关科研项目（2022KJ15）

第一作者：苏小建（1984—），男，汉族，江苏泗洪人，硕士，副主任医师，主要从事卫生检疫研究，E-mail: ericsue007@163.com

通信作者：杨庆贵（1977—），男，汉族，安徽肥东人，博士，主任技师，主要从事病原生物学研究，E-mail: yqg1995@126.com

1. 江苏国际旅行卫生保健中心（南京海关口岸门诊部） 南京 210019

2. 南京中医药大学医学院·整合医学学院 南京 210023

3. 江苏卓微生物科技有限公司 常州 213125

4. 南京海关动植物与食品检测中心 南京 210019

1. Jiangsu International Travel Healthcare Center (Nanjing Customs Port Clinic), Nanjing 210019

2. School of Medicine & Holistic Integrative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023

3. Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd., Changzhou 213125

4. Animal Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs District, Nanjing 210019

Abstract Microfluidic chip is a micro total analysis system which can integrate the basic operations of pretreatment, reaction, separation, detection and collection of the sample to be analyzed. Microchip has attracted wide attention of researchers because of its advantages of small sample consumption, short time consumption, high efficiency and low cost in the process of micro-scale reaction. In this paper, a microfluidic chip based on enzymatic immune reaction was designed, and an integrated and miniaturized rapid detection device was developed for rapid extraction and reaction, with neuraminidase as the detection target, which can be used for rapid detection of related respiratory infectious diseases. The device has the advantages of light weight and high stability, sensitivity and specificity.

Keywords microfluidic chip; immunology; rapid detection; equipment

近年来，各种新发、突发呼吸道传染病的发生和流行，给口岸卫生检疫部门带来巨大的防控压力，在快速通关的要求下，如何快速精准地区分有相似症状的呼吸道传染病是个亟待解决的问题。微流控芯片能够在几个平方厘米甚至更小的尺度上实现对待分析样本进行有效前处理、混合后反应、产物分离、收集和检测等过程^[1]，其密封性、便携性在一定程度上解决了实验室交叉污染的问题^[2]，具有检测灵敏度高、检测通量高、集成度高等诸多优点，可实现快速检测和自动化检测^[3-4]。基于免疫学的微流控检测芯片以抗原抗体结合为基础，具有检测条件宽松、灵敏度高、特异性强等优点，该方法还集成了比色法等检测方法，从而有效减少对外部大型、精密设备的依赖，已在食品检测、环境保护、临床诊断等领域得到广泛应用，针对致病菌^[5]、疾病标志物^[6]、毒素^[7]、核酸检测^[8]等多个检测方向进行了有益探索^[9]。

基于免疫的微流控芯片，根据其基底的特性，主要分为硅基、纸基、高分子聚合物基等，具体可以划分为条带/斑点阵列反应体系、磁珠/颗粒作为固定的技术研究、数字微流控体系的酶检测和离心式驱动微流控的酶检测研究。微流控技术在免疫检测领域展现了小型化、更快速、更具友好性的巨大潜力。但在实际应用中，试纸条、磁珠、数字、离心等微流控芯片技术还存在被检样本量较大、控制相对复杂的缺陷，特别是针对咽拭子等现场无创采样，样本量所得极低，要求更加友好性、小型化和高灵敏度的微流控芯片和设备。因此，课题组创新设计了夹式微流控芯片富集方法和创新的微流控芯片上气泡式流体阀，成功开发了基于酶促免疫反应的微流控芯片，并开发了集成化、小型化、高灵敏度的快速检测设备，更好地满足了便携、加样即得、高灵敏度的现场检测需求，可对呼吸道传染病患者进行快速筛选、甄别以实现在缩短口岸通关时间的同时，提高口岸呼吸道传染病的风险防控水平。

1 基于免疫学微流控芯片的研发

基于免疫学微流控芯片的设计及反应实现，该芯片成功实现了储液、管路流动、气密性贴合等一系列工程问题，其优点主要表现在如下几方面。

1.1 实现了微流控芯片上磁珠与加样孔的隔离和高效富集技术

设计高效的磁珠混合方法，富集咽拭子保存液中的样本，同时物理上防止磁珠被咽拭子表面纤维粘连造成样本的损失。

1.2 实现了微流控芯片上高灵敏度光电信号采集关键技术

设计基于锁相积分放大的光学信号放大方法，提高了检测灵敏度。

1.3 实现了微流控芯片上小型化条件下气泡阀的设计及控制

微流控芯片在满足小型化设备的设计要求及多步反应体系的需求条件下，在芯片上预设集成化的阀，通过设备上气泡控制模块实现微流控芯片上通道的通断控制。在压力驱动下，芯片上预设的反应物能够分步流动控制，从而实现了微流控芯片上多步反应及控制。芯片原理设计见图1，实际制成的微流控芯片见图2。

该芯片自组装式设计体系将反应体系部分与通道层完全隔离，在非使用状态下，储液层上的反应池之间相互独立，避免了反应试剂的污染。使用时通过撕开中间的密封膜一步操作，将上下两层合在一起，实现了芯片上储液层到反应池的相互连接，促进反应体系的通道连接，芯片外小型的隔膜泵及正负压接口，实现样本的驱动。芯片外布置磁场、压力驱动控制等模块，实现了POCT式的酶联免疫反应的微流控芯片。

实线为气路，虚线为液路。1. 气孔-用于切换正压负压以实现液体驱动; 2. 废液; 3. 洗涤液; 4. 洗脱液; 5. 呼吸道样本; 6. 裂解液; 7. 主提取腔、裂解液

图1 芯片设计示意图

Fig.1 Schematic diagram of chip design

图2 微流控芯片成品

Fig.2 Finished microfluidic chip

2 基于免疫学微流控芯片技术的快速检测设备研制

本设备是基于神经氨酸酶活性的酶促反应来实现的，便于现场化快速检测的小型化设备，该设备具有体积小、质量轻、便于携带等优点。

2.1 主机设计

在箱体正前方有液晶控制面板，为主要的仪器操作、显示设备（图3）；设备内部为主机核心设备；在设备上方设有微流控芯片操作区，后方设有USB接口、电源开关、电源指示灯。操作人员可以通过操作电源开关给主机内部通电或者切断电源，指示灯对主机的通电状况进行显示。

图3 检测设备及检测系统主界面

Fig.3 Main interface of detection equipment and detection system

主机主要由多层气动回路驱动模块、小型气源、芯片接口模块、光学检测模块，电器控制模块、人机接口模块等核心部分组成（图4）。多层气动回路驱动模块，完成了设备上压力控制功能的实现；光学检测模块，完成了设备上光路控制及检测的实现；电器控制模块，完成了设备上信号采集及放大的实现；人机接口模块，通过液体显示设备，完成了信号输入、输出功能的实现。

（1）多层气动回路驱动模块：包括管路接口及控制包括气动管路压力的输出及反馈、小型化压力源的选型和固定、小型化开关阀门的选型和设计等内容。该模块集成了压力传感器、小型气源、控制电路、气动阀，实现了复杂电路、气路的小型化集成。多层气动回路驱动模块与小型气源构成了微流控芯片的驱动系统。

1. 电机驱动器; 2. 气源; 3. 软件显示界面; 4. 光学部分; 5. 芯片部分; 6气路部分

图4 桌面样机的组成部分

Fig.4 Components of the desktop prototype

（2）芯片接口模块：采用了多层气路集成技术。机动部件包括设备舱门控制及芯片弹出、芯片接口板的运动控制。通过芯片接口模块，多层回路驱动模块驱动微流控芯片上的微泵、阀门协同作业，促进了管路流动实现，完成基于免疫学的酶促反应过程。

（3）光学检测模块：主要由激发光源、准直透镜、二向色镜、物镜、激发滤光片、发射接收滤光片、接收聚焦镜、光电二极管、控制电路等组成。荧光检测模块通过扫描芯片采样点所获得的荧光强度数据，转换成电信号，输出到软件处理模块。本装置选择了350 nm的紫外线，检测通道为470 nm的蓝光，采用差分放大的方法实现信号的放大和采集。

2.2 控制系统

控制系统设计主要是基于C++的控制软件和嵌入式工业控制机组成。

人机软件接口包括基于arm+linux的硬件平台和在此基础上的Qt C++软件基本界面的设计，包括阀泵的控制和压力驱动过程的自动控制、电机电气部分的程序控制、AD采集、传感器信号采集等IO控制。

下位机主要由气路控制组件、荧光探头组件、运动部件、温控组件等组成，通过串口和CAN通信实现上下位机的通讯控制，实现本设备各个组件的运动配合。

2.3 软件结构

本软件开发平台为嵌入式Linux-arm-Qt体系。整个软件体系包含3个模块：检测模块、历史操作模块、设置模块。

检测模块：实现检测过程的自动化控制。

设置模块：分为新建模式、编辑模式、删除模式、加载模式。

历史模块：历史界面逐行展示历史检测记录，包括样品名称、检测日期、检测结果等信息。可选中历史记录（单选或多选）进行导出和删除。

2.4 检测步骤

（1）开机：打开电源开关，开关指示灯为红色，30 s左右系统进入主界面。

（2）将采好的鼻咽拭子标本等呼吸道样本振荡后，吸取50 μL，加入微流控芯片，将芯片上的膜缓慢拉下后，静置1 min。

（3）设备端软件界面点击“开始”按钮，设备芯片舱门打开，将芯片放入设备中，放置的方向通道面向屏幕，见图5。

图5 芯片放入示意图

Fig.5 Schematic diagram of chip placement

（4）芯片放入后，点击“开始检测”按钮，舱门关上，屏幕提示进入检测过程，整个过程约2 min。

（5）系统提示检测结束，芯片舱门自动打开，取出芯片。

（6）数据分析。点击主界面选择“历史”进入历史数据界面；历史界面逐行展示历史检测记录；所述历史检测记录包括样品名称、检测日期、检测结果等信息。

用户可选中单条或者多条数据导出或者清除选中数据。使用导出功能前需确认USB存储器已连接至仪器并被正确识别。点击复选框以选中所需记录（可多选），再点击左侧栏“导出”按钮，编辑并保存导出文件夹的名称。

2.5 设备检测性能测试

神经氨酸酶作为检测靶标具有高度稳定、高度灵敏等优点^[10]。本设备检测原理为基于神经氨酸酶活性蛋白的酶促反应，其核心反应为：4-甲基伞形酮-N-乙酰-α-D-神经氨酸在pH 5～6、37℃条件下与具有神经氨酸酶活性蛋白作用，生成4-Methylumbelliferone (4-MU) ，在pH＞10条件下，荧光（增强100倍）检出。

测试4-MU（流感病毒表面神经氨酸酶的酶促反应最终产物）的浓度，在微流控芯片上直接加30 μL样本，放入设备中进行检测，结果显示检测信号强度在12.95～410 nmol/mL时与4-MU浓度呈线性关系（R²＝0.9833，见图6）。

图6 4-MU样本浓度梯度检测曲线

Fig.6 Concentration gradient detection curve of 4-MU sample

将神经氨酸酶按梯度浓度稀释后，运用本微流控芯片反应体系进行检测，结果显示，神经氨酸酶样本浓度梯度曲线呈线性关系（R²＝0.9919，见图7），检测最低灵敏度达到6 nmol/mL。

图7 神经氨酸酶样本浓度梯度检测曲线

Fig.7 Concentration gradient detection curve of neuraminidase sample

3 讨论

流感是由甲型、乙型、丙型等流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，对人类健康危害严重，每年全球有数以百万重症病例由流感导致，致死数十万人^[10]。神经氨酸酶（neuraminidase，NA）是分布于流感病毒背膜上的一种糖蛋白，可以协助成熟病毒脱离原来宿主细胞，感染新的细胞^[11]。加拿大卫生部疫苗评价中心与中国食品药品检定研究院合作的研究发现，神经氨酸酶的头部9个氨基酸（ILRTQESEC）高度保守^[12]。NA由4个相同单位亚基连接组成的蘑菇状四聚体NA的分子构造完整时，NA才有活性^[13]。邓涛等^[14]利用流感疫苗神经氨酸酶含量双抗体夹心ELISA法，定量检测流感裂解疫苗单价原液及H1N1、H3N2、BV、BY等病毒的参考品，建立相应标准曲线，研究出在最佳反应条件下，重组NA蛋白参考品浓度在62.5～2000 U/L区间，与荧光强度呈良好的线性关系，R²＞0.99，建立并优化了一种NA活性的荧光底物检测方法^[15]。

具有切割唾液酸的酶活性是NA的重要特点之一，因此在分析疫苗NA的含量时，常使用酶活性检测来体现。采用唾液酸类似物4-MUNANA作为酶底物，与NA反应，待反应结束产生可用于荧光检测的物质4-MU，通过检测4-MU的荧光强度来评价NA的酶活性^[15-16]。基于以上原理，本课题组设计了基于酶促免疫反应的微流控芯片，开发了集成化、小型化的快速检测设备，进行快速提取、反应，以神经氨酸酶作为检测靶标运用该设备进行检测，其检测灵敏度达到6 nmol/mL，测试4-MU荧光强度-浓度梯度曲线R²为0.9833，表明该设备具有轻巧、稳定、灵敏度和特异性高等优点。该设备在呼吸道样本的快速检测方面具有优势，目前已经在实验室收集的流感病例、肺炎链球菌等呼吸道传染病样本中得到了初步验证，下一步还需要进一步的试用与推广。

4 结论

基于免疫学微流控芯片技术的呼吸道传染病快速检测设备以快速、便捷为特点，可满足现场流感等呼吸道传染病的快速筛查和卫生检疫等需求，是微流控芯片应用的有益探索。近年来，随着微流控芯片技术的发展，未来会有更多小型化、自动化、便携式的快速检测设备不断推出，可望用在海关口岸卫生检疫、应急辅助医疗等诸多领域。

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