寇海娟 罗世鹏 刘丽娜 商贵芹

基金项目：2020年常州市第十一批科技计划（CE20205017）

第一作者：寇海娟（1985—），女，汉族，江苏徐州人，本科，高级工程师，主要从事食品接触材料合规评价和法规研究，E-mail: 20228881@qq.com

1. 常州工业及消费品检验有限公司 常州 213000

2. 江苏理工学院化学与环境工程学院 常州 213000

3. 南京海关危险货物与包装检测中心 常州 213000

1. Changzhou Industry and Consumable Products Inspection Company Limited, Changzhou 213000

2. School of Chemical & Environmental Engineering, Jiangsu University of Technology, Changzhou 213000

3. Nanjing Customs Testing Center for Dangerous Goods and Packaging, Changzhou 213000

罗丹明B，又称玫瑰红B或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种具有鲜桃红色的人工合成的碱性荧光染料，也是一种较典型的三苯甲烷类染料，由于其廉价、染色性强且不易掉色被广泛应用于印染行业，也曾被大量用作食品添加剂^[1-7]。

欧洲食品安全局（EFSA）对欧盟食品中几种非法添加着色剂的毒理学评估结果显示，罗丹明B具有潜在的基因毒性和致癌性。正是基于这一危害，罗丹明B不仅被禁用于食品行业，在食品接触材料领域也被严格限制。日本印刷油墨法规中明确禁止使用罗丹明B。在美国加利福尼亚州，含有罗丹明B的产品应在其标签上注明警告。在我国食品接触材料法规标准及公告中，也未授权使用罗丹明B，全球其他国家也未查到关于罗丹明B在食品接触材料中应用的授权^[8-9]。

本文以复合包装袋中罗丹明B为研究对象，开发了超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱的方法，并研究分析了罗丹明B迁移量与含量、材质之间的关系，接触时间和温度下的迁移规律，以期为企业进行产品设计和质量控制提供技术支持。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

罗丹明B，纯度99.0%（购于德国Dr. Ehrenstorfer）；乙腈，色谱纯（购于德国Merck公司）；异丙醇，色谱纯（购于德国Merck公司）；甲醇，色谱纯（购于上海安谱实验科技股份有限公司），针式注射器2 mL和尼龙滤膜0.22 μm（购于上海安谱实验科技股份有限公司）；甲酸，99%（购于国药集团）；丙酮，分析纯（购于国药集团）；乙醇，分析纯（购于国药集团）；水，经超纯水器（德国Merck-Millipore公司）处理后使用；SPE小柱，Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱（60 mg/3 mL）（购于美国Agilent 公司）；氮气，纯度≥99.999%（购于空气化工公司）；其他试剂均为色谱纯。

1.2 设备与仪器

Agilent 6460 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent 公司）；超声波发生器（购于上海科导超声仪器有限公司）；离心机（购于美国Sigma公司）。

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，配备FLD检测器）；超声恒温水浴（购于上海科导超声仪器有限公司）；R-210旋转蒸发仪（购于瑞士BUCHI公司）。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 罗丹明B迁移量测试

罗丹明B标准储备溶液（500 mg/L）：准确称取0.05 g罗丹明B（精确至0.1 mg）于100 mL棕色容量瓶中，用异丙醇超声溶解后定容，作为标准储备液，置于4℃环境避光保存。

50%（v/v）乙醇食品模拟物标准工作溶液：由罗丹明B标准储备溶液（500 mg/L）逐级稀释，50%（v/v）乙醇定容，配制成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L的标准工作溶液。

1.3.2 罗丹明B含量测试

罗丹明B标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取0.1 g罗丹明B（精确至0.1 mg）于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇超声溶解后定容，作为标准储备液，置于4℃避光保存。

标准工作溶液：将罗丹明B标准储备溶液（1000 mg/L）用甲醇逐级稀释，分别配制成浓度为0.001 mg/L、0.0025 mg/L、0.005 mg/L、0.0075 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.05 mg/L、0.075 mg/L和0.1 mg/L的标准工作溶液。

1.4 实验方案

1.4.1 阳性样品筛选

本实验对近100批色泽鲜艳的粉色或红色复合包装材料进行了罗丹明B含量筛查，共筛出4批罗丹明B阳性样品。

1.4.2 迁移试验

因罗丹明B具有脂溶性，且文献已报道^[10]，在水、20%（v/v）乙醇、50%（v/v）乙醇、4%（v/v）乙酸和橄榄油等模拟物中，50%（v/v）乙醇模拟物中罗丹明B迁移量最大，且和橄榄油最接近。因此，本试验仅选择50%（v/v）乙醇作为食品模拟物。将阳性样品制成5 cm×5 cm小袋，以选择50%（v/v）乙醇
作为食品模拟物，填充体积为10 mL，依据GB 5009.156-2016进行迁移试验^[11-12]。

1.4.3 罗丹明B迁移量的测定

迁移试验所得50%（v/v）乙醇浸泡液过0.22 μm滤膜后，采用液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪进行定量分析，检出限为0.0001 mg/L。

1.4.4 罗丹明B含量的测定

将复合包装膜样品剪成小于0.5 cm×0.5 cm的小块，混匀。称取1 g（精确至0.001 g）试样于150 mL锥形瓶中，加入50 mL丙酮，于50℃水浴下超声提取30 min，过滤，收集滤液于250 mL旋转蒸发瓶中，然后再加入50 mL丙酮，重复超声一次，过滤后合并滤液于旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至干，转移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，经0.45 μm滤膜过滤后供高效液相色谱（HPLC-FLD）测定。

1.5 仪器设备条件

1.5.1 液相色谱-质谱条件

液相色谱条件：ZOBRAX-SB-C₁₈（柱长150 mm，内径2.1 mm，粒度1.9 μm）；流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（A，%），0～1 min，80%，1～3 min，80%～98%，3～5 min，98%，5～8 min，98%～80%；流速0.5 mL/min；进样量1 μL；柱温35℃。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；干燥气温度325℃；雾化气压力45 psi；干燥气流量8.0 L/min；鞘气温度350℃；鞘气流量11.0 L/min；多反应监测（MRM）模式，负离子模式。详细质谱分析参数见表1。

表1 罗丹明B检测质谱参数

Table 1 Parameters of mass spectrometry for determination of Rhodamine B

1.5.2 高效液相色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；检测器波长（激发：540 nm，发射：596 nm）；流动相为甲醇（A）和水（B），梯度洗脱（A，%），0～15 min，70%～100%，15～25 min，100%；流速1 mL/min；进样量20 μL；柱温30℃。

2 结果与讨论

2.1 罗丹明B迁移量方法验证

2.1.1 方法检出限和线性范围

按照1.5.1选定的仪器条件下，测定系列标准工作溶液，以食品模拟物中标准工作溶液中罗丹明B的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性方程，罗丹明B迁移量计算参考GB 5009.156-2016的相关规定。50%（v/v）乙醇模拟物中罗丹明B的质量浓度与响应值呈现良好线性关系，线性相关系数为 0.9997。对空白样进行添加，以基线噪声的3倍（S/N＝3）估算所对应罗丹明B的浓度作为检出限，见表2。

表2 线性方程、相关系数和检出限

Table 2 Linear equation, correlation coefficient and LODs

2.1.2 方法回收率和精密度

在空白复合包装样品的浸泡液中分别添加0.001 mg/L、0.02 mg/L、0.5 mg/L 3个不同浓度水平的罗丹明B标准物质，进行罗丹明B添加回收率的重复实验。对每个水平进行6次重复实验，其平均回收率和相对标准偏差（RSD）见表3。

2.2 罗丹明B含量方法验证

2.2.1 检出限及线性范围

在1.5.2选定的仪器参数条件下进行测定标准工作溶液的浓度，以罗丹明B浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其相关投入线性系数为0.9993，结果表明，罗丹明B的质量浓度与响应值在0.001～0.1 mg/L范围内线性良好。对空白样进行添加实验，以基线噪声的3倍（S/N＝3）和10倍（S/N＝10）估算所对应罗丹明B的浓度，罗丹明B含量的检出限为0.0001 mg/L，定量限为0.0003 mg/L。

表3 罗丹明B迁移量测定方法精密度和加标回收率测定结果（n=6）

Table 3 Results of precision and recovery of Rhodamine B migration determination method (n=6)

2.2.2 回收率及精密度

选择不含罗丹明B的复合包装膜进行空白加标实验，所添加的两个不同的浓度水平分别为0.001 mg/L和0.05 mg/L，对每个水平进行6次重复实验，其平均回收率和相对标准偏差（RSD）见表4。

2.3 来源排查

在4批样品上分别取1 m²面积，将干净的沾有无水乙醇滤纸在样品的内外表面用力来回擦拭100次。将擦拭前后的样品用50%（v/v）乙醇模拟物进行迁移试验，试验温度为70℃，2 h，测试浸泡液中罗丹明B，测试结果以mg/L计，4批样品的测试结果如表5所示。

由表5可知，擦拭后棉花中并未检出罗丹明B，而在用棉花擦拭前后，4批样品中罗丹明B迁移量并未见明显变化，且滤纸中并未检出罗丹明B。因此，我们确认对于罗丹明B的迁移并非黏脏或表面污染源所致。

2.4 罗丹明B迁移量与残留量关系

取4批样品，以50%（v/v）乙醇，40℃ 10 d作为迁移试验条件，比较罗丹明B残留量和迁移量之间的关系，测试结果如表6所示。由表6可知，相同样品材质相同试验条件下，罗丹明B残留量越大，迁移量越大。此外，表6中样品A（BOPP/VMCPP）中罗丹明B残留量比样品B高约30%，而罗丹明B迁移量仅为样品B（PA/PE）的2%，这说明镀铝阻隔层的存在可大大阻隔罗丹明B的迁移，降低罗丹明B迁移风险。

表6 罗丹明B残留量和迁移量测试结果比较

Table 6 Comparison of residue and migration of Rhodamine B

2.5 贮存条件对罗丹明B的影响

以样品编号B为研究对象，以50%（v/v）乙醇作为食品模拟物进行迁移试验。接触温度分别为40℃和60℃时，接触时间分别为1 h、2 h、4 h、24 h、3 d、10 d和15 d，浸泡液中罗丹明B浓度如图1、图2所示。

由图1、图2可知，罗丹明B迁移量随接触时间延长呈现增长趋势。不同温度下迁移量增长的趋势略有不同。温度为40℃时，3 d以内增长较为平缓，3～10 d之间增长显著。温度为60℃时，3 d内迁移量增长较为显著，3～10 d之间增幅趋于平缓。在两种温度下当接触时间超过10 d时，迁移量仍存在一定程度的增加。

此外，由上图可知，接触温度越高，罗丹明B迁移量显著增长的拐点越提前。而接触时间越长，温度越高，罗丹明B短时间内迁移风险就增大。因此，含罗丹明B的包装避免长期保存食品的同时，也不应在高温条件下接触食品，特别是油性食品。

3 结语

为研究复合包装中罗丹明B迁移量的影响因素，本文建立了LC-MS/MS联用方法测试罗丹明B迁移量的方法，并考察了复合包装材料中罗丹明B的迁移影响因素。实验数据表明，相同材质样品在接触酒精类食品时，罗丹明B迁移量会随含量增大而增加。此外，阻隔层的存在可大大降低罗丹明B的迁移水平。在相同模拟物中，接触时间的延长和温度的升高，会提高罗丹明B的迁移水平。因此含有罗丹明B的复合包装材料不适用于长期或在高温下保存的食品。

由于复合包装材料中的罗丹明B主要来源于印刷油墨层，尽管印刷油墨夹于复合层中间，在盛装食品时印刷油墨并不直接与食品接触，但同样存在渗透迁移的风险。因此，在印刷油墨配方中应当避免使用致癌、致突变、有毒的原辅材料，以及在国内外明确禁用或存在争议的物质，从源头上控制产品质量，保障食品安全^[13-14]。

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表4 罗丹明B含量测定方法精密度和加标回收率测定结果（n=6）

Table 4  Results of precision and recovery of Rhodamine B content determination method (n=6)

表5 罗丹明B污染来源排查结果

Table 5 Results of pollution source of Rhodamine B

图1 温度为40℃时，不同接触时间下罗丹明B迁移规律

Fig.1 The migration law of Rhodamine B at different contact times at 40℃

图2 接触温度为60℃时，不同接触时间下罗丹明B迁移规律

Fig.2 The migration law of Rhodamine B at different contact times at 60℃