赵相鹏 蒲静 种焱 高志强 杜思乐 白子龙 赖平安 汪琳

由病菌Septoria passerinii Sacc.引起的大麦壳针孢斑点叶枯病是美国中西部和加拿大草原三省种植大麦中发生最为普遍的叶部病害之一。该病害可导致大麦减产20%以上，并导致籽粒干瘪和麦芽提取物下降，从而造成严重的经济损失。另外，1999年在美国北达科他州的试验表明，该病害可导致大麦减产38%以上^[1]。但目前我国未发布针对该病菌的报道。

我国每年进口大麦数百万t、货值超10亿美元^[2]。大麦上携带的病原真菌——麦类条斑病菌Cephalosporium gramineum Nisikado et、燕麦全蚀病菌Gaeumannomy cesgraminis（Sacc.）Arx et D. Olivier var. Avenae（E.M.Turner）Dennis、麦类壳多胞斑点病菌Stagonospora avenae Bissett f. sp. Triticea T. Johnson等已被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》^[3]。目前国内对Septoria passerinii Sacc.病菌的研究较少，这给口岸检疫鉴定带来一定困难，在一定程度上为进口贸易环节有效防范该病菌入侵带来挑战，挑战国门生物安全防控效能。本文根据国外学者的研究成果，详细介绍了该病菌的分类地位、形态学特征、生物学特性等，供口岸检疫鉴定参考。

1 分类地位

学名：Septoria passerinii Sacc.

异名：Zymoseptoria passerinii（Sacc.）Quaedvl.&Crous

英文名：无

分类地位：真菌界Fungi，半知菌亚门Deuteromycotina，腔孢纲Coelamycetes，球壳孢目Sphaeropsidales，球壳孢科Sphaeropsidaceae，壳针孢属Septoria Sacc.^[4]。

2 寄主

该病菌的寄主主要为大麦（Hordeum vulgare）。

3 分布

该病菌主要分布在美国、意大利、加拿大中南部、捷克斯洛伐克、俄罗斯^[4]。

4 生物学特性及危害特征

Septoria passerinii Sacc.在20～24℃下迅速生长，作物成熟后，在15～30℃之间仅可在病斑上产生新的分生孢子器。病菌的分生孢子需要保湿至少48 h才能萌发并侵入叶片引起病害。此外，Septoria passerinii Sacc.需要19 d或更长的潜伏期才能完全出现症状，因此，仅当大麦生长季的天气条件持续有利于病菌生长时，才会致使该病害严重流行^[5]。

Septoria passerinii Sacc.引起的病害的症状因大麦的生长阶段而不同，在生长早期的幼嫩植株上常为独立的小病斑，伴随病害的发生，病斑逐渐连片呈长条状，灰绿色或淡黄色，且病斑部位可产生大量深褐色的分生孢子器。该病害最典型的特征是在受病菌侵染而死亡的组织区域，沿叶脉方向产生大量成排状排列的分生孢子器。分生孢子器还可在麦芒上形成，但很少在籽粒上产孢。在受侵染的大麦茬上越冬的分生孢子器是大麦叶斑病的主要传染源^[5]。

5 孢子形态特征

大麦壳针孢菌Septoria passerinii Sacc.的分生孢子产生于分生孢子器内，常以略带粉色的分生孢子角的形式从孢子器中溢出，分生孢子呈丝状，两端钝圆，具1～3个隔膜。分生孢子大小为23～46 μm，平均36.1 μm×2.4 μm。此外，部分分生孢子中还伴生有小型分生孢子，大小为9.8 μm×1.3 μm^[5]。

6 风险评估

6.1 进入可能性

Septoria passerinii Sacc.在受感染的残留物中越冬，可通过雨水溅起的孢子短距离传播；可通过种子中携带的病残体远距离传播，也可潜伏在病残体内通过国际贸易跨境传播^[6-8]。目前，我国的大麦进口主要来自于澳大利亚、加拿大、丹麦、美国、俄罗斯等国，所以该病菌有进入我国的可能性。

6.2 定殖可能性

口岸卸货、运输过程的撒漏，以及加工厂的筛下物管理不当等，均可造成病菌进入农田而定殖。Septoria passerinii Sacc.在自然条件下可侵染大麦。

研究人员发现，在美国明尼苏达州红河谷区域土壤表面或地下储存2年的病残体中，分生孢子器仍可以产生分生孢子。此外，Septoria passerinii Sacc.在4°C的无菌土壤中储存20个月后仍可以存活，且产生的孢子仍可保持致病性^[9-10]。

我国大麦种植分为春大麦和冬大麦两个生产区域，前者多为冬季严寒地区，主要包括东北、内蒙古、山西、新疆、青海、甘肃、西藏；后者主要以河北以南、东南沿海和云南、贵州为主。该病菌在20～24℃下发展迅速，可通过病残体及被污染的器械进行越冬、再侵染。我国大麦产区具备该病菌定殖的条件，故定殖可能性较大。

6.3 扩散可能性

Septoria passerinii Sacc.在田间自然扩散能力不是很强，可通过雨水和农事操作自然扩散。病菌在病种子和病残体上越冬，在湿润条件下散发分生孢子，通过病残体、污染的工具进行传播。在自然条件下，病菌孢子的传播距离较短，但可通过种子和混在大麦中的病残体进行远距离传播。因此，有一定的扩散可能性。

6.4 经济影响

前文介绍了该病害在美国造成的大麦减产数据，因此，若该病菌传入我国，将会对我国大麦生产造成一定的经济影响。

6.5 检疫措施

如果海关实验室检出该病菌，样品或病组织等需至少保存6个月，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，样品及病组织等需经过高温高压灭菌或其他适当方式进行除害处理。

7 结论与讨论

大麦是我国重要的经济作物，具有食用、饲用、酿造、药用等多种用途，具有悠久的栽培历史^[11-12]。我国是大麦第一进口国，也是大麦净进口国家。2020年我国大麦进口金额为18.8亿美元，进口量达807.95万t，同比增长20.4%；2021年我国大麦进口额为35.56亿美元，进口量1248万t，同比增长54.47%^[2]。随着大麦进口量的增加，大麦上携带的病原真菌种次也逐年上升，大麦种子携带的病原微生物一旦传入我国，将会对我国农业生产造成一定危害。

鉴于Septoria passerinii Sacc.是引起大麦壳针孢斑点叶枯病的致病种，可通过种子中携带的病残体跨境传播，并且在我国大麦产区具备一定的定殖条件和扩散的可能性，建议对该真菌境外发生动态和口岸检疫保持关注，对其加强检验检疫，防止传入我国。

参考文献

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基金项目：深圳海关科研项目（2021SZHK003）

第一作者：史亚千（1983—），女，汉族，陕西华阴人，硕士，高级农艺师，主要从事植物检疫研究，E-mail: shiyaqian0822@163.com

通信作者：王颖（1968—），女，汉族，新疆石河子人，硕士，研究员，主要从事植物病害检疫研究，E-mail: mswy2008@163.com

1. 深圳海关 深圳 518045

2. 深圳市检验检疫科学研究院 深圳 518045

3. 深圳仙湖植物园 深圳 518045

1. Shenzhen Customs, Shenzhen 518045

2. Shenzhen Scientific Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518045

3. Xianhu Botanical Garden of Shenzhen, Shenzhen 518045

基金项目：海关总署科研项目（2020HK132），南京海关科研项目（2022KJ15）

第一作者：苏小建（1984—），男，汉族，江苏泗洪人，硕士，副主任医师，主要从事卫生检疫研究，E-mail: ericsue007@163.com

通信作者：杨庆贵（1977—），男，汉族，安徽肥东人，博士，主任技师，主要从事病原生物学研究，E-mail: yqg1995@126.com

1. 江苏国际旅行卫生保健中心（南京海关口岸门诊部） 南京 210019

2. 南京中医药大学医学院·整合医学学院 南京 210023

3. 江苏卓微生物科技有限公司 常州 213125

4. 南京海关动植物与食品检测中心 南京 210019

1. Jiangsu International Travel Healthcare Center (Nanjing Customs Port Clinic), Nanjing 210019

2. School of Medicine & Holistic Integrative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023

3. Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd., Changzhou 213125

4. Animal Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs District, Nanjing 210019

Abstract Microfluidic chip is a micro total analysis system which can integrate the basic operations of pretreatment, reaction, separation, detection and collection of the sample to be analyzed. Microchip has attracted wide attention of researchers because of its advantages of small sample consumption, short time consumption, high efficiency and low cost in the process of micro-scale reaction. In this paper, a microfluidic chip based on enzymatic immune reaction was designed, and an integrated and miniaturized rapid detection device was developed for rapid extraction and reaction, with neuraminidase as the detection target, which can be used for rapid detection of related respiratory infectious diseases. The device has the advantages of light weight and high stability, sensitivity and specificity.

Keywords microfluidic chip; immunology; rapid detection; equipment

近年来，各种新发、突发呼吸道传染病的发生和流行，给口岸卫生检疫部门带来巨大的防控压力，在快速通关的要求下，如何快速精准地区分有相似症状的呼吸道传染病是个亟待解决的问题。微流控芯片能够在几个平方厘米甚至更小的尺度上实现对待分析样本进行有效前处理、混合后反应、产物分离、收集和检测等过程^[1]，其密封性、便携性在一定程度上解决了实验室交叉污染的问题^[2]，具有检测灵敏度高、检测通量高、集成度高等诸多优点，可实现快速检测和自动化检测^[3-4]。基于免疫学的微流控检测芯片以抗原抗体结合为基础，具有检测条件宽松、灵敏度高、特异性强等优点，该方法还集成了比色法等检测方法，从而有效减少对外部大型、精密设备的依赖，已在食品检测、环境保护、临床诊断等领域得到广泛应用，针对致病菌^[5]、疾病标志物^[6]、毒素^[7]、核酸检测^[8]等多个检测方向进行了有益探索^[9]。

基于免疫的微流控芯片，根据其基底的特性，主要分为硅基、纸基、高分子聚合物基等，具体可以划分为条带/斑点阵列反应体系、磁珠/颗粒作为固定的技术研究、数字微流控体系的酶检测和离心式驱动微流控的酶检测研究。微流控技术在免疫检测领域展现了小型化、更快速、更具友好性的巨大潜力。但在实际应用中，试纸条、磁珠、数字、离心等微流控芯片技术还存在被检样本量较大、控制相对复杂的缺陷，特别是针对咽拭子等现场无创采样，样本量所得极低，要求更加友好性、小型化和高灵敏度的微流控芯片和设备。因此，课题组创新设计了夹式微流控芯片富集方法和创新的微流控芯片上气泡式流体阀，成功开发了基于酶促免疫反应的微流控芯片，并开发了集成化、小型化、高灵敏度的快速检测设备，更好地满足了便携、加样即得、高灵敏度的现场检测需求，可对呼吸道传染病患者进行快速筛选、甄别以实现在缩短口岸通关时间的同时，提高口岸呼吸道传染病的风险防控水平。

1 基于免疫学微流控芯片的研发

基于免疫学微流控芯片的设计及反应实现，该芯片成功实现了储液、管路流动、气密性贴合等一系列工程问题，其优点主要表现在如下几方面。

1.1 实现了微流控芯片上磁珠与加样孔的隔离和高效富集技术

设计高效的磁珠混合方法，富集咽拭子保存液中的样本，同时物理上防止磁珠被咽拭子表面纤维粘连造成样本的损失。

1.2 实现了微流控芯片上高灵敏度光电信号采集关键技术

设计基于锁相积分放大的光学信号放大方法，提高了检测灵敏度。

1.3 实现了微流控芯片上小型化条件下气泡阀的设计及控制

微流控芯片在满足小型化设备的设计要求及多步反应体系的需求条件下，在芯片上预设集成化的阀，通过设备上气泡控制模块实现微流控芯片上通道的通断控制。在压力驱动下，芯片上预设的反应物能够分步流动控制，从而实现了微流控芯片上多步反应及控制。芯片原理设计见图1，实际制成的微流控芯片见图2。

该芯片自组装式设计体系将反应体系部分与通道层完全隔离，在非使用状态下，储液层上的反应池之间相互独立，避免了反应试剂的污染。使用时通过撕开中间的密封膜一步操作，将上下两层合在一起，实现了芯片上储液层到反应池的相互连接，促进反应体系的通道连接，芯片外小型的隔膜泵及正负压接口，实现样本的驱动。芯片外布置磁场、压力驱动控制等模块，实现了POCT式的酶联免疫反应的微流控芯片。

实线为气路，虚线为液路。1. 气孔-用于切换正压负压以实现液体驱动; 2. 废液; 3. 洗涤液; 4. 洗脱液; 5. 呼吸道样本; 6. 裂解液; 7. 主提取腔、裂解液

图1 芯片设计示意图

Fig.1 Schematic diagram of chip design

图2 微流控芯片成品

Fig.2 Finished microfluidic chip

2 基于免疫学微流控芯片技术的快速检测设备研制

本设备是基于神经氨酸酶活性的酶促反应来实现的，便于现场化快速检测的小型化设备，该设备具有体积小、质量轻、便于携带等优点。

2.1 主机设计

在箱体正前方有液晶控制面板，为主要的仪器操作、显示设备（图3）；设备内部为主机核心设备；在设备上方设有微流控芯片操作区，后方设有USB接口、电源开关、电源指示灯。操作人员可以通过操作电源开关给主机内部通电或者切断电源，指示灯对主机的通电状况进行显示。

图3 检测设备及检测系统主界面

Fig.3 Main interface of detection equipment and detection system

主机主要由多层气动回路驱动模块、小型气源、芯片接口模块、光学检测模块，电器控制模块、人机接口模块等核心部分组成（图4）。多层气动回路驱动模块，完成了设备上压力控制功能的实现；光学检测模块，完成了设备上光路控制及检测的实现；电器控制模块，完成了设备上信号采集及放大的实现；人机接口模块，通过液体显示设备，完成了信号输入、输出功能的实现。

（1）多层气动回路驱动模块：包括管路接口及控制包括气动管路压力的输出及反馈、小型化压力源的选型和固定、小型化开关阀门的选型和设计等内容。该模块集成了压力传感器、小型气源、控制电路、气动阀，实现了复杂电路、气路的小型化集成。多层气动回路驱动模块与小型气源构成了微流控芯片的驱动系统。

1. 电机驱动器; 2. 气源; 3. 软件显示界面; 4. 光学部分; 5. 芯片部分; 6气路部分

图4 桌面样机的组成部分

Fig.4 Components of the desktop prototype

（2）芯片接口模块：采用了多层气路集成技术。机动部件包括设备舱门控制及芯片弹出、芯片接口板的运动控制。通过芯片接口模块，多层回路驱动模块驱动微流控芯片上的微泵、阀门协同作业，促进了管路流动实现，完成基于免疫学的酶促反应过程。

（3）光学检测模块：主要由激发光源、准直透镜、二向色镜、物镜、激发滤光片、发射接收滤光片、接收聚焦镜、光电二极管、控制电路等组成。荧光检测模块通过扫描芯片采样点所获得的荧光强度数据，转换成电信号，输出到软件处理模块。本装置选择了350 nm的紫外线，检测通道为470 nm的蓝光，采用差分放大的方法实现信号的放大和采集。

2.2 控制系统

控制系统设计主要是基于C++的控制软件和嵌入式工业控制机组成。

人机软件接口包括基于arm+linux的硬件平台和在此基础上的Qt C++软件基本界面的设计，包括阀泵的控制和压力驱动过程的自动控制、电机电气部分的程序控制、AD采集、传感器信号采集等IO控制。

下位机主要由气路控制组件、荧光探头组件、运动部件、温控组件等组成，通过串口和CAN通信实现上下位机的通讯控制，实现本设备各个组件的运动配合。

2.3 软件结构

本软件开发平台为嵌入式Linux-arm-Qt体系。整个软件体系包含3个模块：检测模块、历史操作模块、设置模块。

检测模块：实现检测过程的自动化控制。

设置模块：分为新建模式、编辑模式、删除模式、加载模式。

历史模块：历史界面逐行展示历史检测记录，包括样品名称、检测日期、检测结果等信息。可选中历史记录（单选或多选）进行导出和删除。

2.4 检测步骤

（1）开机：打开电源开关，开关指示灯为红色，30 s左右系统进入主界面。

（2）将采好的鼻咽拭子标本等呼吸道样本振荡后，吸取50 μL，加入微流控芯片，将芯片上的膜缓慢拉下后，静置1 min。

（3）设备端软件界面点击“开始”按钮，设备芯片舱门打开，将芯片放入设备中，放置的方向通道面向屏幕，见图5。

图5 芯片放入示意图

Fig.5 Schematic diagram of chip placement

（4）芯片放入后，点击“开始检测”按钮，舱门关上，屏幕提示进入检测过程，整个过程约2 min。

（5）系统提示检测结束，芯片舱门自动打开，取出芯片。

（6）数据分析。点击主界面选择“历史”进入历史数据界面；历史界面逐行展示历史检测记录；所述历史检测记录包括样品名称、检测日期、检测结果等信息。

用户可选中单条或者多条数据导出或者清除选中数据。使用导出功能前需确认USB存储器已连接至仪器并被正确识别。点击复选框以选中所需记录（可多选），再点击左侧栏“导出”按钮，编辑并保存导出文件夹的名称。

2.5 设备检测性能测试

神经氨酸酶作为检测靶标具有高度稳定、高度灵敏等优点^[10]。本设备检测原理为基于神经氨酸酶活性蛋白的酶促反应，其核心反应为：4-甲基伞形酮-N-乙酰-α-D-神经氨酸在pH 5～6、37℃条件下与具有神经氨酸酶活性蛋白作用，生成4-Methylumbelliferone (4-MU) ，在pH＞10条件下，荧光（增强100倍）检出。

测试4-MU（流感病毒表面神经氨酸酶的酶促反应最终产物）的浓度，在微流控芯片上直接加30 μL样本，放入设备中进行检测，结果显示检测信号强度在12.95～410 nmol/mL时与4-MU浓度呈线性关系（R²＝0.9833，见图6）。

图6 4-MU样本浓度梯度检测曲线

Fig.6 Concentration gradient detection curve of 4-MU sample

将神经氨酸酶按梯度浓度稀释后，运用本微流控芯片反应体系进行检测，结果显示，神经氨酸酶样本浓度梯度曲线呈线性关系（R²＝0.9919，见图7），检测最低灵敏度达到6 nmol/mL。

图7 神经氨酸酶样本浓度梯度检测曲线

Fig.7 Concentration gradient detection curve of neuraminidase sample

3 讨论

流感是由甲型、乙型、丙型等流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，对人类健康危害严重，每年全球有数以百万重症病例由流感导致，致死数十万人^[10]。神经氨酸酶（neuraminidase，NA）是分布于流感病毒背膜上的一种糖蛋白，可以协助成熟病毒脱离原来宿主细胞，感染新的细胞^[11]。加拿大卫生部疫苗评价中心与中国食品药品检定研究院合作的研究发现，神经氨酸酶的头部9个氨基酸（ILRTQESEC）高度保守^[12]。NA由4个相同单位亚基连接组成的蘑菇状四聚体NA的分子构造完整时，NA才有活性^[13]。邓涛等^[14]利用流感疫苗神经氨酸酶含量双抗体夹心ELISA法，定量检测流感裂解疫苗单价原液及H1N1、H3N2、BV、BY等病毒的参考品，建立相应标准曲线，研究出在最佳反应条件下，重组NA蛋白参考品浓度在62.5～2000 U/L区间，与荧光强度呈良好的线性关系，R²＞0.99，建立并优化了一种NA活性的荧光底物检测方法^[15]。

具有切割唾液酸的酶活性是NA的重要特点之一，因此在分析疫苗NA的含量时，常使用酶活性检测来体现。采用唾液酸类似物4-MUNANA作为酶底物，与NA反应，待反应结束产生可用于荧光检测的物质4-MU，通过检测4-MU的荧光强度来评价NA的酶活性^[15-16]。基于以上原理，本课题组设计了基于酶促免疫反应的微流控芯片，开发了集成化、小型化的快速检测设备，进行快速提取、反应，以神经氨酸酶作为检测靶标运用该设备进行检测，其检测灵敏度达到6 nmol/mL，测试4-MU荧光强度-浓度梯度曲线R²为0.9833，表明该设备具有轻巧、稳定、灵敏度和特异性高等优点。该设备在呼吸道样本的快速检测方面具有优势，目前已经在实验室收集的流感病例、肺炎链球菌等呼吸道传染病样本中得到了初步验证，下一步还需要进一步的试用与推广。

4 结论

基于免疫学微流控芯片技术的呼吸道传染病快速检测设备以快速、便捷为特点，可满足现场流感等呼吸道传染病的快速筛查和卫生检疫等需求，是微流控芯片应用的有益探索。近年来，随着微流控芯片技术的发展，未来会有更多小型化、自动化、便携式的快速检测设备不断推出，可望用在海关口岸卫生检疫、应急辅助医疗等诸多领域。

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基金项目：新疆维吾尔自治区科技支疆项目（2020E02132）

第一作者：巴哈提古丽·马那提拜（1979—），女，哈萨克族，新疆阿勒泰人，博士，高级兽医师，主要从事反刍动物消化道微生物、食品微生物及公共环境微生物的相关检测与研究，E-mail: bahet88@163.com

通信作者：万永亮（1973—），男，汉族，新疆阜康市人，硕士，高级工程师，主要从事放射性检测工作，E-mail: 1293700823@qq.com

1. 乌鲁木齐海关技术中心 乌鲁木齐 830063

1. Urumqi Customs Technical Center, Urumqi 830063

在人类赖以生存的环境中微生物随处可见，空气中的微生物有细菌、真菌、病毒等，它们附着于尘埃粒子、水蒸气等，以气溶胶的形式存在于空气中，对人体造成危害^[1]。空气消毒机的出现，对改善人类生活环境起到了一定的作用。目前室内常规预防性的空气消毒机主要是用物理、化学及其他方法杀灭或去除室内空气中的微生物，是利用带电粒子、过滤技术、紫外线、低浓度化学因子和其他消毒因子产生消毒效果的循环风消毒机或多功能消毒机^[2-3]。不同空气消毒机所释放的消毒因子不同，由于各地气候，环境中的温度、湿度以及人员密集程度不同，常导致所使用的空气消毒机消毒效果存在差异，对环境中的微生物消杀效果不佳，给人类身体健康带来危害^[4]。因此不同的环境中选用适合的空气消毒机、消除环境中的微生物是非常重要的。

本研究采用全离子双风道空气物理消毒机对密闭空间的空气自然菌的消杀效果进行检验，为掌握消毒机对密闭空间自然菌的消杀效果、科学合理的消杀措施和空气物理消毒机的正确选用提供帮助，对提高室内空气质量与提升公共卫生防疫能力具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验设备：全离子双风道空气物理消毒机、六级筛孔空气撞击式釆样器、培养皿、恒温培养箱。

1.1.2 试验环境及材料：实验室（实验时的环境温度21～23℃、湿度45%～55%）、90 mm培养皿、营养琼脂培养基。

1.2 方法

1.2.1 全离子双风道空气物理消毒机原理

该款空气物理消毒机的核心部件是非平衡正负氧离子（又称双极离子）发生器，每片发生器每秒向空气中激发数量上亿（比例为1:3）的正负氧离子，正负氧离子随风漫散空气中，主动、动态消杀细菌，降解有害物质，洁净空气。该款空气物理消毒机采用一种平板多层叠加式的介质阻挡放电结构，内部为高压发射极板，表面为接地极板，发射级与接地级构成一个具有精密尺寸的电场。通过系统控制电极结构和放电参数，使离子发生器在相对较低的电压下工作，可针对空气中氧分子发生激励电离作用，不对空气中氮气电离或对氧气发生离解作用，避免电离时产生臭氧或氮氧化合物。在输入交流高压电流时，可以向空气中交替产生大量非平衡正负氧离子，正负氧离子交替发生具有离子风膨胀效应，且具备较强的活性。离子发生器激发的离子簇与空气浮游菌相遇在细菌表面产生电场，达到对浮游菌的杀灭效果。

1.2.2 预防性消毒采样及检测

（1）自然沉降法。将营养琼脂平板（Ф90 mm）放置各采样点，采样高度为距地面0.8～1.5 m。采样时在布点处铺设无菌纸，平板放置于纸上，将平板盖打开，扣放于平板旁，暴露15 min后盖上平板盖，将平板外表面消毒后放置培养箱进行培养。按照产品使用说明，开启全离子双风道空气物理消毒机（柜式），选择消毒模式最大档位，空气消毒达到1 h、2 h、4 h后，在消毒前采样的相同位置上，另放一组营养琼脂平板。放置方法和暴露时间与消毒前采样相同。同时取2个未经采样的相同平板作为阴性对照，每组做2个平行，试验重复3次。试验组和对照组在36℃条件下，培养48 h后计数，并计算自然菌消亡率^[5]。

（2）撞击法。在房间距离地面1.0 m处，将六级筛孔空气撞击式釆样器置于房间中央进行釆样。以釆样流量为28.3 L/min，采样时间为7 min，作为消毒前样本（阳性对照）。消毒的第1 h、2 h和4 h进行釆样，采样流量为28.3 L/min，采样时间为7 min，作为消毒后的试验样本，进行活菌培养计数，试验重复3次。试验组和对照组在36℃条件下，培养48 h后计数，并计算自然菌消亡率^[6]。

1.3 数据处理

采用excel、SPSS对数据进行统计分析。

1.4 评价指标

空气自然菌消亡率≥90%，判为消毒合格。

2 结果与分析

2.1 物理消毒机对空气自然菌杀菌效果

2.1.1 自然沉降法采集自然菌的结果

采用WS/T 774-2021《新冠肺炎疫情期间现场消毒评价标准》中自然沉降法采样并检测物理消毒机对密闭空间内自然菌的消毒效果，检测结果见表1。由表1可知，经过3次重复试验，测得消毒机在一定消毒时间内对空气中的自然菌均有较好的消毒效果，且在不同试验次数、不同消毒时间下，自然沉降法测得消毒机对空气自然菌的平均消亡率随着消毒时间增加而升高。消毒时间为1 h、2 h和4 h后，对空气自然菌的平均消亡率为分别为84.08%、86.35%和90.63%，依据消毒评级指标，消毒时间在4 h后，可达到消毒合格指标。

表1 自然沉降法测定空气中自然菌的检测结果

Table 1 Detection results of natural bacteria in the air by natural sedimentation method

注: 图中a、b、c表示差异在P＜0.05水平具有统计学意义，下同。

在不同消毒时间条件下，自然沉降法测得消毒机对空气自然菌的检测结果见图1。结果表明消毒时间为1 h、2 h和4 h后测定结果之间存在显著差异性（P＜0.05），消毒时间越长，消毒效果越好。

图1 自然沉降法测得空气中自然菌的检测结果

Fig.1 Detection results of natural bacteria in the air by natural sedimentation method

2.1.2 撞击法采集自然菌的结果

采用撞击法采样并检测物理消毒机对密闭空间内自然菌的检测结果见表2。经3次重复试验，消毒时间为1 h、2 h 和4 h 后的平均消亡率分别为83.13%、86.26%和90.28%，达到消毒合格指标。由此可知，消毒机作用时间越长，对密闭空间微生物的消杀效果越好。

表2 撞击法测定空气自然菌检测结果

Table 2 Detection results of natural bacteria in the air by impact method

撞击法采样测得不同消毒时间条件下，物理消毒机对空气自然菌的检测结果见图2。消毒时间为1 h、2 h和4 h后测定结果之间存在显著性差异（P＜0.05），消毒机消毒时间越长，消毒效果越好。

图2 撞击法测得空气自然菌的检测结果

Fig.2 Detection results of natural bacteria in the air by impact method

2.2 两种采样方法测定消毒机杀菌效果评价

对WS/T 774-2021《新冠肺炎疫情期间现场消毒评价标准》中的自然沉降法和卫生部《消毒技术规范》中的撞击法采样并检测消毒机的消毒效果进行比较，结果如表3。两种采样方法均在消毒1 h、2 h和4 h后达到不同的消毒效果，消杀1 h后消毒效果分别达到84.08%和83.13%；2 h后消毒效果分别达到86.35%和86.26%；4 h后消毒效果分别达到90.63%和90.28%。由方差T检验可知，两种采样方法测得消毒机在同一作用时间下消亡率相近，无显著差异（P＞0.05），且消毒4 h后可达到消毒合格指标。因此，采用两种采样方法中的任意一种均可得到相似的结果。

图3 相同消毒时间不同采样方法测得自然菌检测结果

Fig.3 Detection results of natural bacteria in the air by different methods at the same disinfection time

3讨论

空气消毒器作为在有人、无人情况下均可选用的消毒设备，近年来飞速发展并广泛应用，其提高了消毒净化效果，降低了感染发生率。本研究表明，采用自然沉降法和撞击法采样并检测全离子双风道空气物理消毒机对空气自然菌的消毒效果，两种采样方法在消毒1 h、2 h和4 h后均对密闭空间有消毒效果，平均消亡率随着消毒时间增加而升高，其中以消毒时间4 h后的效果最佳，消亡率在消毒时间4 h后达到90%以上，依据评价指标，满足消毒合格标准。消毒机在消毒时间1 h、2 h和4 h测得的结果之间有显著性差异，消毒时间越长，消毒效果越好。自然沉降法和撞击法测定消毒机对空气自然菌的消亡率在1 h、2 h和4 h后的结果相似，两种采样方法测得结果无差异性。

陈祖毅等^[7]研究了移动式等离子空气消毒机除尘效果，开机2 h对室内空气中尘埃粒子清除率为90.95%。谢斌等^[8]研究发现启动等离子体空气消毒器 1 h、1.5 h、2 h 不同时间后，非洁净手术室的空气细菌数及颗粒物均达到空气质量相关标准。黄和茂^[9]研究DBD等离子体空气杀菌净化器持续运行2 h，杀菌率分别达到93.00%和87.00%。常压下射流式介质阻挡放电低温等离子体对细菌繁殖体、真菌及细菌芽孢都有较好的灭杀作用^[10]。邵树军等^[11]采用自然沉降法测得在无人状态下，空气消毒机工作2 h后杀菌率达到64.46%，消毒后室内空气符合环境标准要求。本文研究结果与上述略有差异，可能与消毒机的构造、性能与功效等存在一定的差异性。本研究采用含有非平衡正负氧离子（又称双极离子）发生器的消毒机，正负氧离子随风漫散在空气中，可动态消杀细菌、降解有害物质、达到洁净空气的效果。数据表明，该款空气消毒机作用时间越长，对室内微生物的消杀效果越好。

室内空气中微生物污染的主要预防技术有通风换气、过滤、化学消毒、臭氧消毒、紫外线消毒、低温等离子体技术等。等离子体空气消毒器是一种经济有效的空气净化消毒装置，其核心是等离子体反应器，该反应器能释放负氧离子等自由基，具有极强活化和氧化能力，对细菌、病毒具有很强杀伤力，同时还能分解甲醛、烟气等高分子有毒有机物，转化成无毒无味的碳、水等无机物，对人和医疗设备无危害^[12]。空气消毒机为契合市场需求应运而生，其不仅可以杀菌消毒，有的机型还能去除室内空气中的甲醛、苯酚等有机污染气体，而且还可以杀灭或者过滤花粉等过敏源。同时，还能有效去除吸烟产生的烟雾和烟味、卫生间的不良气味和人的体味等^[13-14]。

4 结论

单一的检测方法可能对试验结果存在较大差异性，因此，可结合多种试验方法进行检测，减少误差，为提高消毒机的杀菌效果提供有力的科学指导。本研究对全离子双风道空气物理消毒机进行物理消毒后的室内环境进行了效果评价，采用自然沉降法和撞击法采集空气中自然菌并对其进行检测，结果显示该物理消毒机对空气自然菌具有明显的消毒效果，消毒机作用时间越久，对密闭空间微生物的消杀效果越好。

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表3 相同消毒时间不同采样方法测得自然菌检测结果

Table 3 Detection results of natural bacteria in the air by different methods at the same disinfection time

第4卷 第12期

2022年12月

Food Safety / 食品安全

基金项目：江门市基础与理论科技计划项目（江科[2021]183号）

第一作者：易碧华（1983—），女，汉族，本科，工程师，主要从事食品、消费品等理化检测，E-mail: 173705669@qq.com

通信作者：蒋小良（1979—），男，汉族，硕士，高级工程师，主要从事进出口商品分析检测，E-mail: liang96@yeah.net

1. 江门海关技术中心 江门 529000

1. Technology Center of Jiangmen Customs, Jiangmen 529000

Abstract A method for the determination of ethoxyquin residues in farmed fish by solid phase extraction (SPE) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was established. Under weak alkalinity and dehydrating conditions, samples were extracted with n-hexane, purified by alumina N and eluted by methanol. The concentrated and filtered samples were tested by GC-MS and quantified by the external standard method. Under the optimized experimental conditions, the ethoxyquin had good linear relationship ranging from 10.0 to 200 μg/L, and the correlation coefficient was above 0.999. The limit of detection (LOD) was 0.003 mg/kg, and the limit of quantitation (LOQ) was 0.010 mg/kg, The recoveries of negative samples at 3 spiked levels of 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg and 0.05 mg/kg ranged from 88.4% to 105.2%, with relative standard deviations from 2.05% to 4.88% (n＝6). The proposed method is convenient, efficient, reproducible, stable and suitable for the determination of ethoxyquin residues in farmed fish.

Keywords solid phase extraction (SPE); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); farmed fish; ethoxyquin

饲料的腐败变质容易影响养殖鱼的生长性能和免疫系统。乙氧基喹啉具有较好的抗氧化作用，能够有效地防止饲料中油脂和蛋白质的变性或氧化，也能够有效地防止维生素、胡萝卜素等的氧化变质，因此它被广泛应用于饲料当中^[1-4]。乙氧基喹啉随着饲料被动物摄食后，经过肠道被吸收，绝大部分在体内进行代谢转化，最后经肾脏排出体外。由于其具有低廉的价格、优异的抗氧化效果，不少饲料商家在实际生产过程中会使用或者滥用。目前，除欧盟外的其他国家并没有明令禁止使用乙氧基喹啉，摄入过量乙氧基喹啉的养殖鱼，其残留会在人体引起很多毒副作用，对人体造成难以预估的损害^[5-7]。中国、美国、日本、韩国等国家和欧盟地区均制定了乙氧基喹啉在食品和农产品的最大残留量标准。

目前，乙氧基喹啉的检测手段主要有高效液相色谱法^[8-9]、气相色谱法^[10-11]、液相色谱串联质谱法^[12-13]、气相色谱-质谱联用法^[14-15]等。大多数研究是针对植物源性产品中乙氧基喹啉的测定研究，对养殖鱼中乙氧基喹啉测定方法报道较少。乙氧基喹啉具有脂溶性特点，如果鱼饲料中添加了该物质，被养殖鱼摄入后，体内即使有少量残留也能被检测出来。由于液相色谱串联质谱法、气相色谱-质谱联用法具有灵敏度高、选择性和重现性好等优点，广泛应用于实际批量检测中^[16-18]。目前，国外对于养殖鱼中乙氧基喹啉的测试大多在QuEChERS快速处理法的研究^[19-20]。快速处理法对仪器精度的要求比较高，基质影响比较大，而且QuEChERS净化包配料的选择以及配比会直接影响目标物测定的精确度。现行的SN/T 3856-2014中乙氧基喹啉的测定主要通过调节酸碱度溶液来反复提取，有一定的损失，人为操作引入的误差较大，过程不容易控制。因此，有效提取样品中的目标物对结果的影响至关重要。本研究拟从优化萃取条件、中性氧化铝固相萃取等方面进行研究，建立气相色谱质谱联用法测定养殖鱼中乙氧基喹啉残留量的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Trace ISQ 250气相色谱-质谱联用仪（配电子轰击源（EI源），美国热电公司）；CP124S电子天平（精度为0.0001g，德国Sartorius公司）；QT-1涡旋混匀器（上海琪特分析仪器有限公司）；N1全自动氮吹仪（可控温，上海PreeKem公司）；3K15高速离心机（10000 r/min，德国Sigma公司）；MM400型混合球磨仪（德国Retsch公司）；Milli-Reference超纯水机（电阻率15.8 MΩ·cm，美国Millipore公司）。

1.2 材料与试剂

养殖鱼：主要为罗非鱼、泥锰鱼、鳙鱼、鳗鱼等，来源于实验室日常监管抽样。十八烷基键合硅胶柱（C₁₈）、佛罗里硅土柱（Florisil）、中性氧化铝柱(Alumina-N，Cleannert® SPE柱，Agela Technologies公司）；

乙氧基喹啉标准溶液（浓度1000 mg/mL，坛墨质检标准物质中心）；正己烷、甲醇（色谱纯，Bcr international trading. inc）；无水硫酸钠、无水碳酸钠（分析纯，广州化学试剂厂）；试验用水为超纯水。

乙氧基喹啉标准储备液：精确移取一定体积的乙氧基喹啉标准品溶液，用正己烷溶解并配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于4℃下避光保存。

乙氧基喹啉标准工作溶液：分别精确移取一定体积的乙氧基喹啉标准储备液，用正己烷定容为10.0～200.0 μg/L的系列标准工作溶液。

1.3 仪器条件

色谱柱：DB-5 MS，30.0 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：280℃；离子源温度：250℃；接口温度：280℃；四级杆温度：150℃；程序升温：60℃保持1 min，以20℃/min升至260℃，保持1 min，以40℃/min升至280℃，保持5 min；进样量：1 μL；不分流进样；扫描方式：选择离子检测（SIM）；定性离子（m/z）：174、145、217；定量离子（m/z）：202。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取

养殖鱼样品经过均质处理后，称取样品2.0 g（精确至0.001 g）于50 mL具塞离心管中，加入10 mL正己烷，涡旋混合1 min后，再加入1 g无水碳酸钠和1 g无水硫酸钠，经混合球磨仪混合提取5 min，在高速离心机中以10000 r/min离心5 min后，取上清液在40℃条件下氮吹至近干，然后再加入4 mL甲醇分两次复溶，涡旋混匀，待净化。

1.4.2 样品净化

安装固相萃取装置，在Alumina-N小柱加入1 g无水硫酸钠，用2 mL甲醇活化小柱，待净化液过柱后，再用2 mL甲醇洗脱，控制流速为1.0 mL/min，洗脱液一并收集到玻璃管中。洗脱液在40℃下氮吹至近干，加入1 mL正己烷和0.5 mL去离子水复溶，离心分层取上层清液，过0.22 μm有机滤膜，上机待测，同时做样品空白。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

乙氧基喹啉不溶于水，易溶于丙酮、异丙醇、乙醚、正己烷等有机溶剂，本实验中参照标准SN/T 3856-2014中以10 mL正己烷作为提取液。研究表明，在弱碱性条件下，可以抑制乙氧基喹啉的离子化；通过去除样品的水分，乙氧基喹啉提取的效率会进一步提高。因此，本实验采用向正己烷添加不同比例的无水碳酸钠和无水硫酸钠，以达到弱碱性和脱水剂的目的进行提取，按照本实验步骤进行乙氧基喹啉加标回收实验，每个比例进行4次重复测定，以平均回收率进行比较。结果表明，添加1 g无水碳酸钠和1 g无水硫酸钠的10 mL正己烷进行提取回收率最高，见图1。

图1 不同比例提取液下乙氧基喹啉平均回收率（n＝4）

Fig.1 The average recovery of ethoxyquin in different extraction solutions (n＝4)

同时，通过不同的提取时间1～15 min对乙氧基喹啉加标回收率进行比较，发现回收率在混合球磨仪提取时间5 min后基本上达到了稳定，详见图2。

图2 不同提取时间下乙氧基喹啉回收率（n＝4）

Fig.2 The average recovery of ethoxyquin at different

extraction time (n＝4)

2.2 净化条件优化

通过对相同量不同固相萃取柱C₁₈、Florisil和Alumina-N进行回收率的对比。分别对每个用量水平进行4次重复测定，以平均回收率来比较。实验结果表明，当用Alumina-N净化时，乙氧基喹啉的回收率最高，而且可有效去除样品中较多的油脂，降低仪器的基质效应，因此，最终选择Alumina-N作为固相萃取柱，见图3。

图3 不同固相萃取柱下乙氧基喹啉回收率（n＝4）

Fig.3 The average recovery of ethoxyquin with different SPE column (n＝4)

样品在二次氮吹后，上机测试前用正己烷和水复溶有两点好处：一是因为乙氧基喹啉不溶于水，目标物几乎在正己烷层；二是水能有效溶解样品中可溶于水的物质，减少上机测试时离子对的干扰。

2.3 线性范围与检出限、定量限

将配制好的乙氧基喹啉系列标准工作溶液按照质量浓度从低到高依次测试，用乙氧基喹啉的峰面积为纵坐标Y，以其浓度为横坐标X建立标准曲线回归方程，得到相关系数以及线性范围，乙氧基喹啉的选择离子色谱图如图4所示。结果表明，乙氧基喹啉浓度与对应的峰面积呈良好的线性关系，线性方程为：Y＝435.84＋2472.01X，相关系数为0.9995。对阴性样品按本方法处理进行低浓度水平加标，以3倍信噪比（S/N）得出方法的检出限LOD为0.003 mg/kg，以10倍信噪比（S/N）得出方法的定量限（LOQ）为0.010 mg/kg。

2.4 回收率与精密度实验

选取均质后的阴性样品罗非鱼、鳙鱼，定量加入0.01 mg/kg、0.02 mg/kg、0.05 mg/kg 3个浓度水平进行加标试验，每一个添加水平分别重复测定6次，最终测得的回收率为88.4%～105.2%和相对标准偏差为2.05%～4.88%，详见表1。试验结果表明，方法回收率良好，精密度高，可满足实验室检测要求。

图4 乙氧基喹啉的选择离子色谱图

Fig.4 SIM chromatogram of ethoxyquin

2.5 实际样品分析

以日常抽检的养殖鱼样品为例，采用本实验中的预处理方法处理样品和优化的实验条件，与现行标准SN/T 3856-2014预处理方法进行上机测试比较，结果见表2。由表2可知，在20份样品中除了罗非鱼、泥猛鱼、鳙鱼和部分鳗鱼未检出（N.D.）乙氧基喹啉外，有6份鳗鱼样品有检出，但检出的乙氧基喹啉的浓度远远低于对其出口风险筛查的限量，而且两种方法得出的分析结果差别不大。

3 结论

本文基于固相萃取技术，对样品前处理的条件进行优化，建立了固相萃取-气相色谱质谱联用法测定养殖鱼中乙氧基喹啉残留量。实验结果表明，该方法比标准的方法更为简捷，准确度、灵敏度和精密度高，重复性好，能有效检出阳性样品，可作为海关日常监管查验检测养殖鱼中乙氧基喹啉残留量提供参考。

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表1 罗非鱼和鳙鱼的样品加标结果

Table 1 Spiking results of samples of tilapia mossambica and aristichthys nobilis

表2 养殖鱼样品乙氧基喹啉分析结果

Table 2 Analysis results of ethoxyquin residues in farmed fish samples

其中: “N.D.”表示“未检出”

基金项目：2020年常州市第十一批科技计划（CE20205017）

第一作者：寇海娟（1985—），女，汉族，江苏徐州人，本科，高级工程师，主要从事食品接触材料合规评价和法规研究，E-mail: 20228881@qq.com

1. 常州工业及消费品检验有限公司 常州 213000

2. 江苏理工学院化学与环境工程学院 常州 213000

3. 南京海关危险货物与包装检测中心 常州 213000

1. Changzhou Industry and Consumable Products Inspection Company Limited, Changzhou 213000

2. School of Chemical & Environmental Engineering, Jiangsu University of Technology, Changzhou 213000

3. Nanjing Customs Testing Center for Dangerous Goods and Packaging, Changzhou 213000

罗丹明B，又称玫瑰红B或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种具有鲜桃红色的人工合成的碱性荧光染料，也是一种较典型的三苯甲烷类染料，由于其廉价、染色性强且不易掉色被广泛应用于印染行业，也曾被大量用作食品添加剂^[1-7]。

欧洲食品安全局（EFSA）对欧盟食品中几种非法添加着色剂的毒理学评估结果显示，罗丹明B具有潜在的基因毒性和致癌性。正是基于这一危害，罗丹明B不仅被禁用于食品行业，在食品接触材料领域也被严格限制。日本印刷油墨法规中明确禁止使用罗丹明B。在美国加利福尼亚州，含有罗丹明B的产品应在其标签上注明警告。在我国食品接触材料法规标准及公告中，也未授权使用罗丹明B，全球其他国家也未查到关于罗丹明B在食品接触材料中应用的授权^[8-9]。

本文以复合包装袋中罗丹明B为研究对象，开发了超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱的方法，并研究分析了罗丹明B迁移量与含量、材质之间的关系，接触时间和温度下的迁移规律，以期为企业进行产品设计和质量控制提供技术支持。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

罗丹明B，纯度99.0%（购于德国Dr. Ehrenstorfer）；乙腈，色谱纯（购于德国Merck公司）；异丙醇，色谱纯（购于德国Merck公司）；甲醇，色谱纯（购于上海安谱实验科技股份有限公司），针式注射器2 mL和尼龙滤膜0.22 μm（购于上海安谱实验科技股份有限公司）；甲酸，99%（购于国药集团）；丙酮，分析纯（购于国药集团）；乙醇，分析纯（购于国药集团）；水，经超纯水器（德国Merck-Millipore公司）处理后使用；SPE小柱，Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱（60 mg/3 mL）（购于美国Agilent 公司）；氮气，纯度≥99.999%（购于空气化工公司）；其他试剂均为色谱纯。

1.2 设备与仪器

Agilent 6460 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent 公司）；超声波发生器（购于上海科导超声仪器有限公司）；离心机（购于美国Sigma公司）。

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，配备FLD检测器）；超声恒温水浴（购于上海科导超声仪器有限公司）；R-210旋转蒸发仪（购于瑞士BUCHI公司）。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 罗丹明B迁移量测试

罗丹明B标准储备溶液（500 mg/L）：准确称取0.05 g罗丹明B（精确至0.1 mg）于100 mL棕色容量瓶中，用异丙醇超声溶解后定容，作为标准储备液，置于4℃环境避光保存。

50%（v/v）乙醇食品模拟物标准工作溶液：由罗丹明B标准储备溶液（500 mg/L）逐级稀释，50%（v/v）乙醇定容，配制成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L的标准工作溶液。

1.3.2 罗丹明B含量测试

罗丹明B标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取0.1 g罗丹明B（精确至0.1 mg）于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇超声溶解后定容，作为标准储备液，置于4℃避光保存。

标准工作溶液：将罗丹明B标准储备溶液（1000 mg/L）用甲醇逐级稀释，分别配制成浓度为0.001 mg/L、0.0025 mg/L、0.005 mg/L、0.0075 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.05 mg/L、0.075 mg/L和0.1 mg/L的标准工作溶液。

1.4 实验方案

1.4.1 阳性样品筛选

本实验对近100批色泽鲜艳的粉色或红色复合包装材料进行了罗丹明B含量筛查，共筛出4批罗丹明B阳性样品。

1.4.2 迁移试验

因罗丹明B具有脂溶性，且文献已报道^[10]，在水、20%（v/v）乙醇、50%（v/v）乙醇、4%（v/v）乙酸和橄榄油等模拟物中，50%（v/v）乙醇模拟物中罗丹明B迁移量最大，且和橄榄油最接近。因此，本试验仅选择50%（v/v）乙醇作为食品模拟物。将阳性样品制成5 cm×5 cm小袋，以选择50%（v/v）乙醇
作为食品模拟物，填充体积为10 mL，依据GB 5009.156-2016进行迁移试验^[11-12]。

1.4.3 罗丹明B迁移量的测定

迁移试验所得50%（v/v）乙醇浸泡液过0.22 μm滤膜后，采用液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪进行定量分析，检出限为0.0001 mg/L。

1.4.4 罗丹明B含量的测定

将复合包装膜样品剪成小于0.5 cm×0.5 cm的小块，混匀。称取1 g（精确至0.001 g）试样于150 mL锥形瓶中，加入50 mL丙酮，于50℃水浴下超声提取30 min，过滤，收集滤液于250 mL旋转蒸发瓶中，然后再加入50 mL丙酮，重复超声一次，过滤后合并滤液于旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至干，转移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，经0.45 μm滤膜过滤后供高效液相色谱（HPLC-FLD）测定。

1.5 仪器设备条件

1.5.1 液相色谱-质谱条件

液相色谱条件：ZOBRAX-SB-C₁₈（柱长150 mm，内径2.1 mm，粒度1.9 μm）；流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（A，%），0～1 min，80%，1～3 min，80%～98%，3～5 min，98%，5～8 min，98%～80%；流速0.5 mL/min；进样量1 μL；柱温35℃。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；干燥气温度325℃；雾化气压力45 psi；干燥气流量8.0 L/min；鞘气温度350℃；鞘气流量11.0 L/min；多反应监测（MRM）模式，负离子模式。详细质谱分析参数见表1。

表1 罗丹明B检测质谱参数

Table 1 Parameters of mass spectrometry for determination of Rhodamine B

1.5.2 高效液相色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；检测器波长（激发：540 nm，发射：596 nm）；流动相为甲醇（A）和水（B），梯度洗脱（A，%），0～15 min，70%～100%，15～25 min，100%；流速1 mL/min；进样量20 μL；柱温30℃。

2 结果与讨论

2.1 罗丹明B迁移量方法验证

2.1.1 方法检出限和线性范围

按照1.5.1选定的仪器条件下，测定系列标准工作溶液，以食品模拟物中标准工作溶液中罗丹明B的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性方程，罗丹明B迁移量计算参考GB 5009.156-2016的相关规定。50%（v/v）乙醇模拟物中罗丹明B的质量浓度与响应值呈现良好线性关系，线性相关系数为 0.9997。对空白样进行添加，以基线噪声的3倍（S/N＝3）估算所对应罗丹明B的浓度作为检出限，见表2。

表2 线性方程、相关系数和检出限

Table 2 Linear equation, correlation coefficient and LODs

2.1.2 方法回收率和精密度

在空白复合包装样品的浸泡液中分别添加0.001 mg/L、0.02 mg/L、0.5 mg/L 3个不同浓度水平的罗丹明B标准物质，进行罗丹明B添加回收率的重复实验。对每个水平进行6次重复实验，其平均回收率和相对标准偏差（RSD）见表3。

2.2 罗丹明B含量方法验证

2.2.1 检出限及线性范围

在1.5.2选定的仪器参数条件下进行测定标准工作溶液的浓度，以罗丹明B浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其相关投入线性系数为0.9993，结果表明，罗丹明B的质量浓度与响应值在0.001～0.1 mg/L范围内线性良好。对空白样进行添加实验，以基线噪声的3倍（S/N＝3）和10倍（S/N＝10）估算所对应罗丹明B的浓度，罗丹明B含量的检出限为0.0001 mg/L，定量限为0.0003 mg/L。

表3 罗丹明B迁移量测定方法精密度和加标回收率测定结果（n=6）

Table 3 Results of precision and recovery of Rhodamine B migration determination method (n=6)

2.2.2 回收率及精密度

选择不含罗丹明B的复合包装膜进行空白加标实验，所添加的两个不同的浓度水平分别为0.001 mg/L和0.05 mg/L，对每个水平进行6次重复实验，其平均回收率和相对标准偏差（RSD）见表4。

2.3 来源排查

在4批样品上分别取1 m²面积，将干净的沾有无水乙醇滤纸在样品的内外表面用力来回擦拭100次。将擦拭前后的样品用50%（v/v）乙醇模拟物进行迁移试验，试验温度为70℃，2 h，测试浸泡液中罗丹明B，测试结果以mg/L计，4批样品的测试结果如表5所示。

由表5可知，擦拭后棉花中并未检出罗丹明B，而在用棉花擦拭前后，4批样品中罗丹明B迁移量并未见明显变化，且滤纸中并未检出罗丹明B。因此，我们确认对于罗丹明B的迁移并非黏脏或表面污染源所致。

2.4 罗丹明B迁移量与残留量关系

取4批样品，以50%（v/v）乙醇，40℃ 10 d作为迁移试验条件，比较罗丹明B残留量和迁移量之间的关系，测试结果如表6所示。由表6可知，相同样品材质相同试验条件下，罗丹明B残留量越大，迁移量越大。此外，表6中样品A（BOPP/VMCPP）中罗丹明B残留量比样品B高约30%，而罗丹明B迁移量仅为样品B（PA/PE）的2%，这说明镀铝阻隔层的存在可大大阻隔罗丹明B的迁移，降低罗丹明B迁移风险。

表6 罗丹明B残留量和迁移量测试结果比较

Table 6 Comparison of residue and migration of Rhodamine B

2.5 贮存条件对罗丹明B的影响

以样品编号B为研究对象，以50%（v/v）乙醇作为食品模拟物进行迁移试验。接触温度分别为40℃和60℃时，接触时间分别为1 h、2 h、4 h、24 h、3 d、10 d和15 d，浸泡液中罗丹明B浓度如图1、图2所示。

由图1、图2可知，罗丹明B迁移量随接触时间延长呈现增长趋势。不同温度下迁移量增长的趋势略有不同。温度为40℃时，3 d以内增长较为平缓，3～10 d之间增长显著。温度为60℃时，3 d内迁移量增长较为显著，3～10 d之间增幅趋于平缓。在两种温度下当接触时间超过10 d时，迁移量仍存在一定程度的增加。

此外，由上图可知，接触温度越高，罗丹明B迁移量显著增长的拐点越提前。而接触时间越长，温度越高，罗丹明B短时间内迁移风险就增大。因此，含罗丹明B的包装避免长期保存食品的同时，也不应在高温条件下接触食品，特别是油性食品。

3 结语

为研究复合包装中罗丹明B迁移量的影响因素，本文建立了LC-MS/MS联用方法测试罗丹明B迁移量的方法，并考察了复合包装材料中罗丹明B的迁移影响因素。实验数据表明，相同材质样品在接触酒精类食品时，罗丹明B迁移量会随含量增大而增加。此外，阻隔层的存在可大大降低罗丹明B的迁移水平。在相同模拟物中，接触时间的延长和温度的升高，会提高罗丹明B的迁移水平。因此含有罗丹明B的复合包装材料不适用于长期或在高温下保存的食品。

由于复合包装材料中的罗丹明B主要来源于印刷油墨层，尽管印刷油墨夹于复合层中间，在盛装食品时印刷油墨并不直接与食品接触，但同样存在渗透迁移的风险。因此，在印刷油墨配方中应当避免使用致癌、致突变、有毒的原辅材料，以及在国内外明确禁用或存在争议的物质，从源头上控制产品质量，保障食品安全^[13-14]。

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表4 罗丹明B含量测定方法精密度和加标回收率测定结果（n=6）

Table 4  Results of precision and recovery of Rhodamine B content determination method (n=6)

表5 罗丹明B污染来源排查结果

Table 5 Results of pollution source of Rhodamine B

图1 温度为40℃时，不同接触时间下罗丹明B迁移规律

Fig.1 The migration law of Rhodamine B at different contact times at 40℃

图2 接触温度为60℃时，不同接触时间下罗丹明B迁移规律

Fig.2 The migration law of Rhodamine B at different contact times at 60℃

基金项目：海关总署科技项目（2020HK140）

第一作者：赵相鹏（1987—），男，汉族，山东日照人，本科，兽医师，主要从事动物检疫和物种鉴定，E-mail: zhaoxiangp@163.com

通信作者：汪琳（1974—），女，汉族，湖北随州人，博士，研究员，主要从事动物检疫和物种鉴定，E-mail: 15301090661@189.cn

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

Abstract Based on multiple alignment of mitochondrial gene of feline species such as tiger, lion and leopard published on GenBank, a pair of specific primers and a double labeled probe were designed and synthesized according to a tiger-specific SNP site for the detection of tiger-derived materials. At the same time, another pair of primers and the probe labeled with different fluorescein, which were targeted to the myostatin gene, were synthesized as the internal amplification control (IAC). By optimizing the reaction system, a duplex real-time PCR was established to detect tiger-derived materials. With good specificity and sensitivity, it could detect tiger-derived materials in animal products effectively and could control the quality of sampling and nucleic acid extraction. A total of 15 samples including tiger hair, tiger feces, leopard hair and cat hair were detected by the developed real-time PCR. The results showed that it could detect and identify tiger-derived materials specifically, and had no cross reaction with samples from other felines. The duplex real-time PCR can be used for accurate and rapid detection of suspected tiger products intercepted at ports and tracking of wild animals established in this study. This study provided a more specific rapid detection method for protecting endangered tiger species and combating smuggling of tiger products.

Keywords animal products; tiger derived materials; real-time PCR identification

虎（Panthera tigris）是哺乳纲的大型猫科动物，共有9个亚种，现存6个亚种，分别为西伯利亚虎（Panthera tigris altaica）、华南虎（Panthera tigris amoyensis）、孟加拉虎（Panthera tigris tigris）、印度支那虎（Panthera tigris corbetti）、马来亚虎（Panthera tigris jacksoni）和苏门答腊虎（Panthera tigris sumatrae）^[1]。虎的皮毛华贵美丽，古时是身份地位的象征；虎骨具有祛风通络、强筋健骨的功效，是传统的名贵中药材。在人类贪婪的捕获猎杀、野外栖息环境碎片化等影响下，虎成为珍稀濒危物种，目前被列为《濒危野生动植物种国际贸易公约》CITES附录Ⅰ级保护动物、《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》（IUCN）濒危/极危动物、我国一级野生保护动物。我国拥有4个虎亚种，是世界上虎物种最多的国家，为保护虎物种濒危资源，我国早于1993年就发布了《关于禁止犀牛角和虎骨贸易的通知》，并将犀角和虎骨从中医药典中删除^[2]。2018年，国家林业和草原局再次发布消息严格禁止虎及其制品贸易，严禁虎骨入药^[3]。虎及虎制品（虎骨、皮毛等）属于濒危野生动物及动物制品，禁止贸易、携带、邮寄进出境。然而在巨额利润驱使下，虎及其制品的走私违法案件仍屡禁不止。我国边境口岸经常截获疑似虎骨、虎骨酒/虎鞭酒等制品，有些制品无法通过形态学进行准确鉴定，不利于海关执法，因而，亟须对口岸截获的疑似虎源性制品进行精准鉴定。

基因条形码技术已经广泛应用于物种鉴定领域。国内外研究学者根据虎的线粒体cytochrome b（Cytb）、NADH dehydrogenase subunit 5（ND5）、D-LOOP等基因建立了虎的物种鉴定和进化分析方法^[4-6]。我国已经发布行业标准SN/T 5338-2021《虎物种鉴定 实时荧光PCR方法》^[7]。在实际检测中，由于濒危制品往往经过深加工，一方面，核酸提取较为困难；另一方面，如果实验室检测人员操作不当，非常容易污染待测样品，导致鉴定失败。本研究聚焦现有虎物种鉴定的特异性问题，通过对猫、虎、豹、狮等猫科动物线粒体基因比对，找出虎种特异性SNP位点，进行引物探针设计筛选，同时，选择单拷贝哺乳动物通用序列作为内参靶标，建立了含有虎特异性靶基因和哺乳动物通用内参基因的双重荧光PCR检测方法，能够在特异性鉴定虎源性成分的同时，对样品采集及核酸提取进行质控。本方法首次针对虎种特异性SNP位点建立TaqMan荧光PCR检测方法，为实验室精准鉴定虎源性成分提供技术手段，可应用于口岸截获的疑似虎制品及野外调查中虎疑似样品的物种鉴定。

1 材料和方法

1.1 虎线粒体基因质粒、内参基因质粒的合成及虎等动物材料的收集

参照GenBank中华南虎的参考序列（NC_01477 0.1），合成其Cytb基因全长（1140 bp）并克隆入pUC57载体，得到华南虎线粒体基因质粒（Amoyensis-Cytb-pUC57），作为虎源性成分鉴定的阳性质控品；参照GenBank虎生长抑制素基因的参考序列（XM_007094682.2），合成其MSTN基因全长（1311 bp）并克隆入pUC57载体，得到MSTN基因质粒（MSTN-Cytb-pUC57），作为虎源性成分鉴定的内参质控品；两种质粒均由上海生工合成。采集虎及其近源物种、动物骨粉等材料：西伯利亚虎虎血、虎毛及其粪便；孟加拉虎虎血、虎毛及其粪便；金钱豹血、金钱豹毛及其粪便、亚洲狮毛、云豹毛等（以上样品采集自北京、上海等3个动物园），猫拭子、猫毛、牛骨粉、猪骨粉、羊骨粉、鹿骨粉等均为实验室保存样品。为确保样品来源明确可靠，所采集的各种动物的毛发样品均直接取自于动物体表或单独饲养的笼舍中。

1.2 主要试剂

TIANamp微量样品基因组DNA提取试剂盒（DP316）购自天根生化科技有限公司；Ex HS Taq DNA聚合酶、10×Ex Taq PCR Buffer、dNTP、MgCl₂等均购自TaKaRa公司。

1.3 引物探针设计合成

从Genbank数据库下载现存6个虎亚种及狮、豹、猫等其他猫科动物的线粒体细胞色素b基因序列，通过对线粒体基因Cytb的多重比对（图1），分析得到虎种特异性SNP位点，设计特异性引物及TaqMan探针，该引物探针具有虎的种属特异性、与其他猫科物种不发生交叉，同时兼具虎种的通用性。同时，选择哺乳动物肌肉生长抑制素基因（myostatin，MSTN）作为内参基因，参考文献已经报道的引物探针建立方法^[8]。两对引物探针均由上海生工合成，引物探针的名称、序列及靶基因见表1。

1.4 双重荧光PCR方法建立和优化

使用ABI QuantStudio5荧光PCR仪对引物、探针、Mg²⁺等各组分浓度进行优化，并对最优反应参数进行筛选、验证。

1.5 标准曲线的建立

将西伯利亚虎全血提取核酸并测定浓度，再做10倍系列稀释，使用建立的双重荧光PCR方法进行检测，选取其中5个梯度，以Ct值的平均值为纵轴，核酸浓度为横轴，进行线性回归分析并作标准曲线，计算回归系数（R²）和PCR扩增效率。

图1 虎等猫科动物Cytb基因多重序列比对

Fig.1 Multiple sequence alignment of Cytb gene of Tigers and other feline species

1.6 双重荧光PCR方法最低检测限测定

为精确测定检测方法的最低检测限（limit of detection，LOD），对0.5～16 copies的合成质粒Amoyensis-Cytb-pUC57（含华南虎Cytb基因）和MSTN-Cytb-pUC57（含虎种MSTN基因）进行每个梯度8管的重复检测，应用优化的双重荧光PCR反应体系进行检测，采用概率回归确定方法在95%置信度的LOD。

1.7 特异性试验

应用建立的反应体系，对采集的西伯利亚虎血、孟加拉虎血、金钱豹血、亚洲狮毛、猫拭子、牛骨粉、猪骨粉、羊骨粉、鹿骨粉提取核酸后，与华南虎的线粒体基因合成质粒同时进行检测，验证方法的特异性。

1.8 方法应用与比对

应用建立的双重荧光PCR方法对采集的各种动物毛发、动物骨粉进行实际应用检测，并与现行行业标准方法进行比较^[7]。

2 结果

2.1 双重荧光PCR反应条件优化

经优化确立的虎双重荧光PCR反应体系为：每个反应体系均包含1×Ex Taq PCR Buffer、200 nmol/L dNTP、0.4 μmol/L虎通用引物对、内参基因通用引物对；0.2 μmol/L两种探针。反应参数为：95℃ 3 min；94℃ 15 s，54℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环；每个循环60℃时收集荧光信号。

2.2 双重荧光PCR标准曲线与扩增效率计算

西伯利亚虎全血提取核酸后，测定浓度为141.5 ng/μL，作10倍系列稀释并使用建立的双重荧光PCR方法进行检测，选取浓度为1.415×10¹～1.415×10⁵ ng/μL的5个点建立标准曲线（图2），多次重复试验显示Ct变异系数小于5%，均一性良好，表明方法的灵敏度可以满足要求。

图2 双重荧光PCR灵敏度试验

Fig.2 Sensitivity test of duplex real-time PCR

图2检测结果经计算后进行线性回归，获得的相关数据及方程图形见图3，其中虎的PCR反应效率为102.66%、MSTN的PCR反应效率为104.46%；R²均为1，表明建立的双重荧光PCR方法扩增效率较高。

图3 双重荧光PCR多重标准回归曲线

Fig.3 Multiplex standard regression curve of duplex real-time PCR

2.3 双重荧光PCR检测灵敏度LOD

应用优化的双重荧光PCR对0.5～16 copies的合成质粒Amoyensis-Cytb-pUC57和MSTN-Cytb-pUC57进行每个梯度8管的重复检测，对检测结果采用概率回归进行分析。结果如图4所示，显示本方法对虎源性成分的LOD为4.83 copies（95%置信度），对内参基因MSTN成分的LOD为4.90 copies（95%置信度）。

2.4 特异性试验

使用建立的双重荧光PCR方法，对采集的西伯利亚虎血、孟加拉虎血、金钱豹血、亚洲狮毛、猫拭子、牛骨粉、猪骨粉、羊骨粉、鹿骨粉进行核酸提取，与华南虎的线粒体基因合成质粒同时进行检测。结果如图5所示，显示建立的检测方法能够检测出全部虎种（西伯利亚虎、孟加拉虎和华南虎），且与其他物种DNA无交叉反应，特异性良好。

图5 双重荧光PCR特异性试验

Fig.5 Specificity test of duplex real-time PCR

2.5 方法应用比对

应用本研究建立的双重荧光PCR方法和现行行标方法SN/T 5338-2021对采集自北京、上海的3个动物园的虎、狮、豹等猫科动物的毛发、粪便和不同动物骨粉同时进行检测，结果见表2。根据表2数据，两种方法的检测特异性均为100%，其中建立的双重荧光PCR方法的检测敏感性为90.2%，行标方法的检测敏感性为89.1%；总符合率为99.3%。表明两种方法检测结果符合率较高，无显著差异。

3 分析与讨论

3.1 引物探针的设计合成

线粒体DNA条形码可实现快速、准确和自动化的物种鉴定，常用的线粒体基因有CO-1、Cytb、16S等，目前国内外学者均针对Cytb基因建立了虎物种鉴定方法，包括现行行标^[4-7]。虎属于猫科动物，猫科又分为猫亚科和豹亚科，共有14属38种^[1]，研究表明，尽管猫科动物Cytb基因序列在不同种属和个体变异位点占比达64.9%以上，但这些变异位点在科内各物种间具有分散和不确定性，根据这些变异位点的系统发育分析，雪豹、金钱豹、狮、虎聚为一支，亲缘关系更近，因此，仅选用虎种内序列保守区进行引物探针设计可能出现特异性不足的问题^[9]。在本研究中，同时对虎、豹、狮和猫的线粒体基因序列进行多重比对分析，筛选出特异性SNP位点进行荧光探针设计，在覆盖虎不同亚种检测通用性的基础上，又能保证虎物种的检测特异性。实际检测应用实验也验证了本研究建立的荧光PCR方法能够特异性地检测出不同虎亚种，与狮、豹、猫等均无交叉反应，特异性良好。

3.2 核酸提取与质量控制

濒危野生动物制品往往经过深加工处理，如制成工艺品、中药原料等。虎制品中的虎骨、虎牙、虎骨粉、虎骨酒等是常见的走私物品。一方面，难以通过外观识别进行准确鉴定，只能借助于分子检测技术；另一方面，深加工工艺等可能造成核酸的断裂和损失，给分子鉴定也带来一定困难。因此，如何有效提取核酸、保证PCR成功扩增也成为本研究的重点。研究表明，MSTN基因在哺乳动物细胞内为单拷贝核基因^[8,10]，可对核酸扩增过程的误差进行监控，目前已经被广泛作为动物源性成分定量检测的内参基因。而在物种定性检测中，常常选择18S基因作为内参基因^[11]。但18S基因广泛存在于真核生物细胞中，核酸丰度高，在实际检测应用中常常受环境DNA影响而出现假阳性，从而干扰结果判定。我们在研究中发现，MSTN单拷贝基因的Ct值相对靠后，很少出现非特异扩增，因此对于质控样品采集和核酸提取的有效性优势更为明显。因此，本研究选取单拷贝核基因MSTN作为内参基因，引用已经发表的引物探针序列^[9]，经过体系优化，结合虎物种特异性引物探针，建立双重荧光PCR检测方法，在实现虎源性成分特异性检测的同时，能够对核酸提取和扩增进行有效质量控制。

毛发在野生动物物种鉴定及溯源中是比较常见的材料。完整的毛发一般包括毛根和毛干，毛根距离毛囊较近，往往携带较多的宿主细胞，距离毛根较近的毛干部分往往也会携带一些宿主细胞。而毛干本身由角质层、皮质层和中央髓质层组成，其结构组成主要为角化的纤维蛋白，但仍然含有少量DNA，目前有很多能够提取微量基因组DNA的商品化试剂盒，通常可有效提取到核基因DNA和线粒体DNA。在法医学研究中，采用无根毛发成功鉴定DNA的案例也多有报道^[12-13]。在本研究中，虎毛样品采集自虎舍，属于自然脱落的毛发，一般带有毛根，使用天根的微量基因组核酸提取试剂盒，均成功提取了虎毛的核酸，虎源性成分和内参基因扩增结果均为阳性。在特异性试验中，猫拭子、其他物种的动物骨粉，均未检测到虎源性成分，但同时内参基因MSTN扩增结果均为阳性，表明动物骨粉的DNA也能够正常提取。哺乳动物骨骼富含骨细胞和钙质，在土壤中半衰期长达521年，因此即便是陈旧的骨骼，经有效脱钙后也可以分离到足够检测的DNA，而对于浸泡在酒里的骨骼，由于乙醇的固定作用，DNA更不易于被破坏^[14]。由于濒危管制政策，本研究没有获取到虎骨粉，但研究团队在日常针对陈旧犬骨、鹿骨的检测中均能提取到有效的DNA进行检测鉴定，而本研究建立的虎骨检测方法的LOD低于5 copies，已接近PCR理论检测极限，理论上可以检出陈旧虎骨制品的DNA。结合以往经验，针对深加工或者DNA含量少的材料的物种鉴定，一方面可以通过充分脱钙、延长消化时间、选取高质量或者专门提取微量基因组的核酸提取试剂，保证核酸有效提取；另一方面，可在检测方法中增加通用型内参基因的检测，来对核酸提取和扩增进行有效质量控制。

3.3 方法LOD测定与应用

对于荧光PCR检测，最低检测限测定非常必要，常规测定方法主要通过模板有限稀释法来估算方法的最低检测限。徐君怡等^[15]通过将虎肉粉与牛肉骨粉进行混合制备不同百分比样品进行虎源成分含量测定，确定方法的灵敏度。由于低模板样品检测率为一随机事件，其概率模型服从泊松分布，因此使用概率回归方法进行LOD测定更能精确反映方法的灵敏度^[16]。因此本研究采用概率回归方法进行了虎源性成分双重荧光PCR法LOD的测定，结果显示双重荧光PCR方法对虎特异性成分和内参基因的LOD均小于5 copies（95%置信度），表明本研究所建方法的LOD已经接近荧光定量PCR的理论检测极限，适用于未知样品中微量虎源性成分的检测鉴定。对采集的动物毛、粪便等样品的实际检测结果表明，本研究建立的方法能够检出微量陈旧粪便中的虎源性成分，可应用于野外动物痕迹监测溯源。

3.4 已知背景样品的检测应用

本研究使用来源和背景清晰的样品将所建方法和现行行标方法进行比对。结果显示，两种方法的特异性均为100%，但老虎粪便的检测结果显示，使用现行行标方法在59份虎粪便样品中检出49份阳性，有10份未检出；使用双重荧光PCR方法检测出50份虎源性成分，有9份未检出；仅有1份样品有差异。使用双重荧光PCR方法检测发现，这10份检测为阴性的虎粪便样品的内参基因检测结果均比较弱。推测粪便样品中本身来自老虎的DNA含量比较少，再加上在采集时，部分粪便已经干硬或风化，导致其中老虎DNA核酸降解，进而导致PCR扩增失败。

4 结论

本研究通过对猫科物种线粒体基因序列的多重比对分析，找出虎物种特异鉴别位点，设计一对虎通用引物和探针，并加入哺乳动物内参基因检测引物探针，经反应体系和条件优化，建立了能够特异性检测虎源性成分的双重荧光PCR检测方法。灵敏度概率回归分析显示LOD小于5 copies（95%置信度），特异性试验表明不与其他猫科近源物种发生交叉反应。方法应用与比对结果表明，本方法可以对动物毛发、动物骨粉进行特异性鉴定，可为濒危物种保护、海关执法、野生动物监测溯源等提供技术手段。

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表1 双重荧光PCR引物、探针

Table 1 Primers and probes used in duplex real-time PCR

图4 双重荧光PCR对虎（A）Cytb基因和（B）内参基因MSTN检测的LOD分析

Fig.4 LOD analysis of duplex real-time PCR for (A) tiger Cytb gene and (B) MSTN gene

表2 猫科动物毛发、粪便和常见动物骨粉中虎源性成分检测结果

Table 2 Results of tests on tiger-derived materials in hair, feces and common animal bone meal