黎财慧 王小玉 闫邦奇 游淑珠 姚丽峰 冯家望

利用光催化作用将染料与死菌结合，使PCR检测试验中死菌扩增受到抑制，活菌扩增不受影响，能有效避免假阳性结果^[1-2]，这种能够区分活/死菌的检测研究一直备受关注。传统的病原菌检测耗时较长，通常需要3～5 d。随着现代分子生物学的发展，普通PCR和实时荧光PCR在实验中被更广泛地应用，但这两种方法都存在无法检测活/死菌的问题^[3-4]。叠氮溴化乙锭（ethidium monoazide bromide，EMA）能在强光催化作用下穿过破损细胞膜进入死菌细胞，与死菌的DNA反应产生共价结合，使死菌DNA无法被PCR扩增而不影响活菌的荧光染料^[5]。目前，光催化过程使用的光源有大功率卤素灯^[6-7]、LED光解仪^[8]、自制大功率LED蓝光装置等。本文运用前期研究的叠氮溴化乙锭结合实时荧光PCR（ethidium monoazide bromide real-time PCR，EMA-RT-PCR）快速检测沙门氏菌活菌的技术，从光源组成、作用机理、纯培养样本检测等方面对3种光源进行对比分析，以便于实验人员选择合适的光源进行活菌检测研究。

1 光源组成

1.1 卤素灯实验装置

由实验室自行组装而成。大功率卤素灯、碘钨灯、卤钨灯为一类，此处统称为卤素灯，通常由500～750 W的大功率发热光源、风扇等外置冷却装置、冰块、置物架等组成。

1.2 LED光解仪

由厂家提供。该仪器由样品放置孔位、蓝色热稳定的LED光源、内置冷却装置、定时装置组成。

1.3 自制大功率LED蓝光装置

由实验室自行装配完成。仪器由样品定位孔、大功率蓝色LED灯带、外置温度监控装置、铝箔组成的光线反射收集装置、外置冷却装置等组成。

2 EMA作用机理及各光源的操作

2.1 EMA作用机理

目前，绝大多数学者所接受的活菌判定标准为：细菌细胞膜受损且不再具有代谢活性，在适宜的生存条件下无法恢复生长的菌体^[9]。EMA无法进入活菌的完整细胞，但能够通过破损细胞膜进入死菌细胞中与DNA结合，在可见光（最大吸收波长为464 nm）作用下，EMA中的光敏基团与死菌DNA结合产生共价体，使其无法进行后续的PCR扩增，未结合的残留EMA在持续强光照射下与水分子继续反应生成稳定化合物，使得残留的EMA在后续反应过程中无法与活菌DNA产生链接反应，从而使活菌的DNA能正常进行PCR扩增^[10-11]。光反应的效果与光源种类、光照时间、菌液和染料配比等相关。

2.2 光源的操作方法

2.2.1 卤素灯操作方法

使用500～750 W的大功率卤素灯光源，将样品倾斜放置在距离光源15～30 cm位置的冰浴中，光照反应5～30 min，在保证样品得到光敏反应所需吸收波长的同时，活菌不会因高温致死。

2.2.2 LED光解仪操作方法

利用LED代替卤素灯光源，由于光敏反应的最大吸收波长为464 nm^[12]，蓝色LED发出的波长与卤素灯的波长基本一致^[10]。将样品放置在LED光解仪器中，设定光反应时间后打开灯源开关，仪器内置散热装置自动启动，光照反应5～30 min。

2.2.3 自制大功率蓝光装置操作方法

借鉴蓝色LED波长与卤素灯效果基本一致的观点^[10]，将样品放入样品定位孔中，打开温度监控、外置散热、反射光收集装置，光照反应5～30 min。

3 材料与方法

3.1 菌株

试验所用菌株为肠炎沙门氏菌（CCTCC AB 94018），现保存于本实验室。

3.2 主要试剂和仪器

沙门氏菌培养基购自北京陆桥有限公司。

试剂：Chelex-100购自美国SIGMA公司；EMA购自美国Biotium公司；Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）购自宝生物工程（大连）有限公司；DEPC水购自上海生工生物公司。

仪器：7500 FAST型实时荧光PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

3.3 引物和探针

参考SN/T 1870-2016《出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》合成沙门氏菌引物和探针。正向引物：5'-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3'；反向引物：5'-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3'；探针：FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-BHQ1。

3.4 实验方法

3.4.1 沙门氏菌培养及其活/死菌菌悬液制备

将沙门氏菌菌株纯培养物于生理盐水中混匀。根据本实验室前期已测得的麦氏浊度仪与沙门氏菌的浓度关系，制备活菌菌悬液并调节菌液浓度至2.5×10⁶ CFU/mL；取该浓度活菌菌悬液置于100℃水浴中热致死10 min，得到死菌菌悬液。同时，将处理后的菌悬液用PCA进行倾注平板法计数，36℃培养48 h，以确定死菌菌悬液是否完全灭活。

3.4.2 菌株DNA模板提取

本试验采用10% Chelex-100提取方法，取菌悬液1 mL于灭菌离心管中，12000 r/min离心5 min。弃上清，在沉淀中加入100 μL 10% Chelex-100溶液，漩涡振荡5～10 s；56℃水浴30 min，漩涡振荡5～10 s；100℃水浴10 min，取出漩涡振荡5～10 s；12000 r/min离心5 min，取上清液作为DNA模板。

3.4.3 RT-PCR检测体系的建立

RT-PCR反应体系（25 μL）：Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）12.5 μL，正向引物1.0 μL（10 μmol/L），反向引物1.0 μL（10 μmol/L），探针1.0 μL（10 μmol/L），DEPC水7.5 μL，DNA模板2 μL。

反应条件：95℃预变性3 min，94℃变性5 s，60℃退火延伸40 s，同时收集FAM荧光，进行45个循环。Ct值＜36，可判定样品结果为阳性。

3.4.4 不同光解装置对活菌的检测

根据本实验室前期研究的沙门氏菌EMA作用条件，取制备好的2.5×10⁶ CFU/mL活菌菌悬液4份于灭菌离心管中，分别加入终浓度为2.5 μg/mL的EMA工作液，混匀后避光反应5 min，分别放入3款光解装置中曝光10 min，按照3.4.2所述方法提取DNA，采用3.4.3所述的反应体系和条件进行RT-PCR反应，每组3个平行，并设1个无光照反应的空白对照。

3.4.5 不同光解装置对死菌的检测

取制备好的2.5×10⁶ CFU/mL死菌菌悬液于灭菌离心管中，分别加入终浓度为2.5 μg/mL的EMA工作液，混匀后避光反应5 min，分别放入3款光解装置中光解10 min，按照3.4.2所述方法提取DNA，采用3.4.3所述的反应体系和条件进行RT-PCR反应，每组3个平行，并设1个无光照反应的空白对照。

3.4.6 不同光解装置对同体积活菌与死菌混合液的检测

取制备好的同体积的2.5×10⁶ CFU/mL活菌菌悬液和死菌菌悬液4份加入离心管中，加入终浓度为2.5 μg/mL的EMA工作液，暗反应5 min后分别放入3款光解装置中光解10 min，按照3.4.2所述方法提取DNA，采用3.4.3所述的反应体系和条件进行RT-PCR反应，每组3个平行，并设1个无光照反应的空白对照。

4 结果与讨论

4.1 不同反应装置对活菌的检测结果

不同反应装置对活菌的检测结果见表1。3款装置的活菌检测效果均较好，活菌Ct值＜36，为阳性，均与空白对照相差不大，活菌的PCR扩增均正常。卤素灯和LED光解仪的平行样品检测数值都比较平均，变化不明显；自制光解装置3个平行样品的扩增正常，检测数值对比其他两款装置变动稍大，说明其稳定性稍差。

4.2 不同反应装置对死菌的检测结果

不同反应装置对死菌的检测结果见表2。卤素灯和LED光解仪检测Ct值＞36，结果均为阴性，与空白对照的Ct值相差约为11，说明死菌得到很好抑制；且这两款装置的平行样品检测数值都比较平均，差异不明显；自制光解装置3个平行样品出现一个样品检测Ct值＜36，为阳性，两个样品检测Ct值＞36，为阴性。与空白样品相比，3款光反应装置对于死菌都产生了抑制作用，且卤素灯和LED光解仪的效果好于自制光解装置。

表1 不同光反应装置对活菌的检测结果

Table 1 Results of viable bacteria detection by different photoreaction devices

表2 不同光反应装置对死菌的检测结果

Table 2 Results of dead bacteria detection by different photoreaction devices

由于在4.2节所述死菌检测结果中，自制蓝光装置的数据变化稍大，因此针对该装置，增加实验组和平行样品检测，检测结果见表3。从检测结果可知，增加平行样品检测并取平均值后，该装置死菌检测的Ct值均大于36，为阴性，效果良好。

4.3 不同反应装置对同体积活菌与死菌混合液的检测

不同种检测光源对同体积活死菌试验数据见表4。卤素灯、LED光解仪和自制蓝光装置检测的Ct值均小于36，活菌PCR扩增均未受到影响，死菌受到抑制，光解作用效果良好。卤素灯和LED光解仪的3组平行样品数值比较平均。

表4 不同光反应装置对混合菌检测结果

Table 4 Results of mixed bacteria detection by different photoreaction devices

5 结论

光反应产物结合死菌DNA效率的主要影响因素包括光源种类、光照时间、菌液浓度、EMA浓度等。各光源因光谱不同、稳定性、人为操作等原因，影响光反应的效果^[13-14]。

卤素灯在使用中仍存在较多问题，目前市场上没有相关成品，只能自行购买零件进行组装。大功率光源产生热量极高，试验需要将样品倾斜置于冰上进行，以确保样液在获得充分光照的同时保证菌的活性，因此一般要求样品离光源15～30 cm；整个操作容易产生污染，并且由于人为操作的不确定性，试验结果也会受到影响。

用同波长的蓝色LED替代卤素灯，根据上述试验结果，两者效果相当。蓝色LED所产生的热量比卤素灯小很多，其自带的冷却装置能防止样品过热，又能避免过多的人为操作产生试验误差。多个LED灯珠位点的分布能够使样品光照均匀，操作简便，并且能保证试验结果的准确性。

自制大功率蓝光装置也是考虑了波长与卤素灯相当的问题。计算好样品孔位，缠绕蓝色LED灯带，使样品孔位的前后左右及下方都有足够的光照提供。并且外置铝箔收集散射光，使反射出去的光线再次汇聚到样品上。外置的温度监控和风扇能在监测样品温度的同时达到散热的目的，保证试验结果。该装置能大大减少实验设备经费的支出。从上述试验结果对比可以看出，该装置在活菌和死菌的检测上效果与其他两款设备基本一致。由于该蓝色LED灯带为装饰性产品，缺乏统一行业标准，光效和显色性等都存在不确定性，死菌的检测结果不够稳定，如果使用该装置，建议将平行样品的检测数量增加到5个，并取平均值，以减少试验误差。

本研究从实际出发，比对了活菌检测试验中常用的光源设备，并通过试验数据分析了光源作用的效果及优劣性，能够为实验人员在选择合适光源装置上提供数据参考。

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基金项目：珠海市科研项目（ZH22036201210211PWC），拱北海关科技计划项目（2021GK011）

第一作者：黎财慧（1979—），女，汉族，海南琼海人，本科，农艺师，主要从事微生物学与分子生物学研究，E-mail: 54769709@qq.com

通信作者：冯家望（1965—），男，汉族，湖北荆州人，硕士，研究员，主要从事食品工程及食品安全研究，E-mail: 1696074@qq.com

1. 拱北海关技术中心 珠海 519015

1. Gongbei Customs Technical Center, Zhuhai 519015

表3 自制蓝光装置对死菌的检测结果

Table 3 Results of dead bacteria detection by self-made blue light apparatus