王金凤 高雅欣 姜彦芬 孙晓霞 刘立兵 刘岳林 袁万哲 王建昌

Abstract Based on the single copy gene sodA of M. haemolyticus, a ddPCR assay for the quantitative detection of M. haemolyticus was developed after the optimization of reaction condition and system. The results showed that the developed M. haemolytica ddPCR assay had good specificity. Both of the LOD and LOQ were 170 CFU/mL, and the coefficient of variation of three parallel tests were less than 25%, which demonstrated good repeatability. For the gradient diluted pure culture solution of M. haemolyticus, the accurate quantification of M. haemolyticus could be realized by the developed ddPCR assay, and the deviation compared with plate counting was less than 4%. Among the 15 cow nose swab samples, M. haemolyticus DNA was detected in 10 samples by the developed ddPCR assay with the content calculated as 3.07×10²～9.52×10⁴ CFU/mL. The developed ddPCR assay was suitable for the accurate quantitative analysis of M. haemolytica in clinical swab samples, and can provide effective technical supports for the monitoring and treatment of M. haemolytica infection in cattle.

Keywords Mannheimia haemolytica; single copy sodA gene; droplet digital PCR; plate counting; quantitative detection

溶血曼氏杆菌属于曼氏杆菌属，为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，呈α溶血。溶血曼氏杆菌分为12个血清型，其中1型是导致牛羊呼吸道疾病综合征的主要病原菌之一^[1]。溶血曼氏杆菌是寄居在动物机体上呼吸道的条件致病菌，主要感染牛和羊，能够引起败血症、乳房炎以及牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）^[2]。近年来，由溶血曼氏杆菌引起的败血症、乳房炎以及牛呼吸道疾病不断增多，给我国以及全球畜牧业造成了重大的经济损失^[3]。

目前，传统的分离鉴定法是溶血曼氏杆菌感染检测的“金标准”[4]。一般需要经过病理解剖，将患病动物的肺脏和呼吸道分泌物处理后接种到培养基上，通常需要4～6 d才能完成分离培养。分离培养过程中对于具有相似形态的菌落，需要进一步进行纯化，分离过程较为繁琐，检验周期较长^[5]；对于样本中存在的活的非可培养（Viable but non-culturable，VBNC）状态细菌，通常无法通过分离培养的方法进行检测，但是会引起动物临床症状的产生^[6]。基于特异性核酸扩增的分子生物学方法，如PCR法、qPCR法，已经广泛应用于溶血曼氏杆菌的检测[7^-8]，但无法实现对病原的精准定量分析，且在目标菌含量较低时可能会出现“假阴性”或可疑结果，导致无法进行结果判定。因此，建立一种能够实现溶血曼氏杆菌精准定量检测方法显得尤为重要。

微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的原理是将反应液微滴化，形成数万个微滴，目标核酸分子随机分布到微滴中，每个微滴中含有或不含目标分子。经PCR扩增反应后，进行每个微滴的荧光信号分析，将含有荧光信号的微滴判读为1，不含荧光信号判读为0，通过泊松分布计算反应体系中目标核酸分子的浓度，从而实现对目标核酸分子的绝对定量^[9]。与qPCR方法相比，ddPCR技术的定量方式不依赖于标准曲线，且灵敏性和准确度均高于qPCR方法。目前ddPCR技术已被广泛应用于动植物病原、食源性致病菌精准定量检测领域^[10-11]。本研究以溶血曼氏杆菌编码超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的单拷贝基因sodA为靶基因，建立了溶血曼氏杆菌的ddPCR定量检测方法，以期为牛鼻拭子样品中溶血曼氏杆菌的精准定量分析提供一种有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 试剂与材料

血琼脂平板培养基、营养肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；ddPCR预混液（不含dUTP）、微滴反应板、微滴发生盖、微滴式数字PCR Oil购自美国BIO-RAD公司；TIANamp Bacterial DNA Kit购自天根生化科技（北京）有限公司；肺炎克雷伯氏杆菌（CICC 22956）、沙门氏菌（ATCC 4352）购自中国微生物菌种保藏中心；溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌和多杀性巴氏杆菌均为本实验室分离菌；昏睡嗜血杆菌和牛支原体的DNA均为样品中获得阳性核酸经验证并保存于本实验室；15份牛鼻拭子样品均采自河北省不同地区具有呼吸道症状的奶牛。

1.1.2 仪器

Nanodrop2000c超微量分光光度计（美国Thermo Fisher公司）；Quant Studio5荧光PCR仪（美国ABI公司）；QX200^TMddPCR微滴生成仪、QX200^TM微滴读取仪和PX1^TM热封仪（美国BIO-RAD公司）；T-Gradient梯度PCR仪（德国Biometra公司）。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank已发布的溶血曼氏杆菌基因组序列（登录号：KX679392、EF178278、MT211626、KX679393.1、 CP006619.1、AY702512.1、CP011099.1），选取其单拷贝基因sodA为靶序列，参考已发表文献[12]中的引物和探针序列，上游引物F：5′-ATTAGTGGGTTGTCCTGGTTAG-3′，下游引物R：5′-GCGTGATTTCGGTTCAGTTG-3′，探针P：5′-CTGAACCAACACGAGTAGTCGCTGC-3′，探针5′端标记FAM，3′端标记BHQ1，送由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 平板计数

取溶血曼氏杆菌保存液200 μL直接接种于血平板，（36±1）℃培养24 h后，挑取3个单菌落接种于5 mL营养肉汤中（36±1）℃培养24 h。取1 mL纯培养液加入9 mL 0.85%氯化钠溶液中，依次稀释至10^-9，吸取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9 5个稀释度菌悬液1 mL分别添加至营养琼脂平板上，每个稀释度做3个平行，37℃培养24 h。选取菌落数在30～300 CFU之间的平板进行计数，取平均值，以此推算原始菌落总数，并使用0.85%氯化钠溶液进行10倍倍比稀释，使之浓度在1.0×10²～1.0×10⁶ CFU/mL。

1.4 细菌基因组DNA提取

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取肺炎克雷伯氏杆菌、沙门氏菌、溶血曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的基因组DNA，并经Nano Drop 2000c进行浓度和纯度的测定，确保提取DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间。根据公式1计算其拷贝数，并使用TE缓冲液进行10倍列稀释，使之浓度在1.0×10⁰～1.0×10⁶ copies/μL之间。同时，分别吸取200 μL浓度在1.0×10²～1.0×10⁶ CFU/mL之间的溶血曼氏杆菌纯菌液，提取其基因组DNA。

(1)

式（1）中，代表提取的细菌基因组拷贝数浓度（copies/μL）；m代表超微量分光光度计测得的核酸浓度（ng/μL）；n代表细菌基因组的长度（bp）。

1.5 ddPCR方法的建立和优化

1.5.1 退火温度的优化

设置不同的退火温度对ddPCR反应条件进行优化，反应体系为25 μL，其中ddPCR Supermix for Probes（no dUTP）10 μL，上下游引物ddPCR-F/R终浓度为900 nmol/L，探针ddPCR-P终浓度为250 nmol/L，模板（1.0×10³ copies/μL）2 μL，补水至20 μL。反应条件为95℃预变性10 min；94℃变性30 s，分别设置退火温度为62℃、61.6℃、60.8℃、59.7℃、58.3℃、57.2℃、56.4℃、56℃，延伸30 s，循环45次；98℃酶失活10 min。每个温度进行3次重复实验，以确定最佳退火温度。

1.5.2 引物和探针浓度的优化

按照1.5.1确定的最佳退火温度和反应条件，采用方阵试验对ddPCR反应体系进行优化。反应体系为25 μL，其中ddPCR Supermix for Probes（no dUTP）10 μL，分别设置上下游引物ddPCR-F/R终浓度为400 nmol/L、600 nmol/L、900 nmol/L、1200 nmol/L，探针ddPCR-P终浓度为200 nmol/L、250 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L，模板（1.0×10³ copies/μL）2 μL，补水至20 μL。每个浓度进行3次重复实验，以确定最佳引物探针浓度。

1.5.3 延伸时间和循环数的优化

按照1.5.1和1.5.2确定最佳反应条件和最佳反应体系，采用分组试验对延伸时间和循环数进行优化，设定3个组合：30 s，45个循环；50 s，45个循环；50 s，40个循环，每组重复3次，以确定最佳延伸时间和循环数。

1.6 ddPCR方法的特异性试验

以溶血曼氏杆菌基因组DNA（1.0×10³ copies），以及多杀性巴氏杆菌、昏睡嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、牛支原体、肺炎克雷伯杆菌、沙门氏菌基因组DNA（均为1.0×10⁵ copies）为模板，根据上述优化的反应体系和反应条件进行ddPCR检测，分析所建立ddPCR方法的特异性。特异性实验进行3次重复。

1.7 ddPCR方法的灵敏性试验

以10倍倍比稀释的溶血曼氏杆菌纯菌液提取的基因组DNA为模板，根据上述优化的反应体系和反应条件进行ddPCR检测。每个浓度进行3次重复。反应结束后通过微滴读取仪进行读数。根据ddPCR测定结果与对应菌悬液浓度的换算公式，分别计算每个浓度梯度所含菌悬液的浓度，公式如下：

(2)

式（2）中，代表对应菌悬液浓度（CFU/mL）；N代表20 μL ddPCR反应体系中测得的核酸拷贝数（拷贝/20 μL）；V₁代表提取核酸的最终定容体积（μL）；V₂代表ddPCR反应体系中加入的核酸模板体积（μL）；V₃代表提取的菌悬液体积（mL）。

1.8 临床样品检测

将采集的15份鼻拭子样品分别加入1 mL无菌PBS缓冲液，充分震荡混匀，8000 rpm离心10 min，取离心后的沉淀进行细菌基因组DNA提取。应用ddPCR方法对以上样品进行溶血曼氏杆菌的检测，同时参照文献[13]中提供的qPCR方法进行溶血曼氏杆菌的检测。

2 结果与分析

2.1 平板计数结果

根据平板计数法确定溶血曼氏杆菌初始菌液浓度为1.0×10⁸ CFU/mL，即菌落计数Lg值为8.00。

2.2 ddPCR反应体系及反应条件的优化

不同退火温度的扩增结果显示，当退火温度为58.3℃时，阳性及阴性微滴可显著分成两簇，两簇中间弥散微滴数目较少，阴阳性微滴间距最大，阳性微滴数量最多，分布更为集中，微滴荧光信号最强，扩增结果最好。3次重复结果一致，确定最佳退火温度为58.3℃（图1A）。

设置4组引物和探针浓度进行优化，每组浓度重复3次。结果显示，引物及探针浓度分别为600 nmol/L和250 nmol/L时，阳性微滴数量最多且分布更为集中、荧光信号强，与阴性微滴显著分开，阴阳性微滴间距最大，可获得最大扩增效率（图1B）。确定ddPCR最佳反应体系为：ddPCR Supermix for Probes（no dUTP）10 μL，ddPCR-R/F引物各1.2 μL（终浓度为600 nmol/L），ddPCR-P 0.5 μL（终浓度为250 nmol/L），模板2 μL，水补至20 μL。

延伸时间和循环次数组合扩增结果显示，当延伸时间为50 s，循环45次时，阳性与阴性微滴两簇中间弥散微滴数目较少，扩增结果最好（图2B）。3次重复结果一致（图2）。因此，确定溶血曼氏杆菌ddPCR方法的最佳反应条件为：95℃ 10 min；94℃ 30 s，58.3℃ 50 s，45次循环；98℃酶失活10 min。

图2 延伸时间和循环次数优化结果

Fig.2 Optimization of extension time and number of cycles

2.3 ddPCR方法的特异性试验结果

结果显示，只有溶血曼氏杆菌基因组DNA扩增出阳性微滴，而多杀性巴氏杆菌、昏睡嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、牛支原体、肺炎克雷伯杆菌、沙门氏菌基因组DNA和阴性对照均只有阴性微滴（图3），说明所建立的ddPCR检测方法特异性良好。

图3 ddPCR方法特异性试验结果

Fig.3 Specificity results of ddPCR assay

2.4 ddPCR方法的灵敏性试验结果

分别吸取200 μL各梯度稀释的溶血曼氏杆菌纯菌液提取DNA，以此为模板进行ddPCR检测，在1.0×10⁶～1.0×10² CFU/mL菌液测得的阳性微滴数量和菌体基因组浓度呈明显的梯度下降趋势（图4、表1），最低可检测到1.0×10² CFU/mL。在整个定量检测有效动态范围内，3个平行检测结果的变异系数均小于25%（表1），呈现出良好的重复性。基于ddPCR检测结果，根据公式（2）计算对应原菌液浓度（CFU/mL），结果显示，ddPCR最低检出限（LOD）和定量限（LOQ）均为170 CFU/mL（表1）。

2.5 ddPCR定量结果与平板计数测定结果的比较

溶血曼氏杆菌经24 h培养后，通过ddPCR方法和平板计数方法测定菌液浓度。平板计数结果为1.0×10⁸ CFU/mL，其Lg值为8.00；ddPCR方法对1.0×10⁶～1.0×10² CFU/mL（平板计数测定值）范围内测得的菌液浓度分别乘以对应稀释倍数，计算出原菌液浓度为1.15×10⁸～1.73×10⁸ CFU/mL，其Lg值范围为8.06～8.24，偏差均小于4%；平均值为8.19，比平板计数结果高0.19个Lg值（表1）。进一步分析表明，ddPCR的定值结果与平板计数结果间存在良好的相关性，相关系数R²＝0.998（图5）。

2.6 临床样品检测

对15份牛鼻拭子提取到的DNA同时进行qPCR和ddPCR检测。结果显示，10份样品为溶血曼氏杆菌核酸阳性，其余均为阴性，两种方法检测结果一致。进一步分析表明，10份阳性样品中溶血曼氏杆菌的含量在3.07×10²～9.52×10⁴ CFU/mL之间，RSD值为1.59%～11.80%，均在可接受范围内（RSD＜25%）（表2）。

图5 ddPCR定值结果与平板计数的相关性

Fig.5 Correlation between ddPCR and plate counting results

3 讨论

自ddPCR技术问世以来，国内外已有多个应用ddPCR技术进行致病菌定量检测的相关研究。魏咏新等^[13]以hlyA为靶基因建立了大肠埃希氏菌的快速定量检测方法，并以三文鱼为样品进行阳性添加，比较平板计数、qPCR和ddPCR方法的测定值，结果ddPCR定量检测技术特异性良好、灵敏度高、结果准确。李丹等^[14]建立了水产品中溶藻弧菌ddPCR快速定量检测方法，其定值结果与传统平板计数方法相差0.04个对数值，定量结果、检测重复性以及检出率均优于qPCR。Hansen J等^[15]比较了平板计数、流式细胞仪和ddPCR 3种检测方法对益生菌产品中益生菌的定量检测，表明ddPCR 方法对益生菌计数结果与平板计数和流式细胞仪结果呈正相关，并可以鉴别菌株。

本研究以高保守性、单拷贝的sodA基因作为靶序列^[16-17]，建立了溶血曼氏杆菌ddPCR精准定量检测方法。在ddPCR结果分析中，阳性微滴和阴性微滴之间存在具有中间荧光值的液滴现象，常称为“雨”。大量的“雨”将导致无法准确定义判定阈值，影响样品的定量结果^[18]。有研究表明，ddPCR的循环次数和延伸时间可能对出现在阴性和阳性之间的液滴“雨”影响较大。为了提高ddPCR的准确性和可信度，本研究对一系列反应条件等进行了优化，发现延长延伸时间（50 s）或者增加循环次数（45次）均可减少溶血曼氏杆菌ddPCR结果中“雨”的出现。

基于对溶血曼氏杆菌纯培养物的定量分析结果，ddPCR结果与平板计数结果呈高度正相关（R² = 0.998）。由于DNA提取试剂盒不能完全去除样品中游离DNA，所建立的ddPCR方法不能区别死菌与活菌，同时能够检测到平板计数方法不能检测的VBNC状态细菌，因此，本研究中ddPCR方法的定量结果略高于平板计数结果，平均高出0.19个Lg值。临床样品中细菌种类复杂，样品种类和运输条件也会对细菌的分离和计数产生影响，并且溶血曼氏杆菌的分离对培养条件要求也较高，因此，本研究建立的ddPCR方法更适用于临床样品中溶血曼氏杆菌的定量分析。

本研究的不足在于没有从鼻拭子样品中成功分离到溶血曼氏杆菌。目前，该菌的分离主要采用病死牛的心血、肺、肝、脾等组织脏器，其中使用最多的是肺脏[19^-20]。研究表明，牛鼻拭子样品和气管穿刺液样品或肺泡灌洗液样品的病原菌分离结果仅有中等一致性（Kappa = 0.47）[21^-22]。在实际分离中鼻拭子样品中存在大量杂菌，也在一定程度上影响了溶血曼氏杆菌的分离效果。本研究中虽然没有从ddPCR阳性的鼻拭子样品中分离出目标菌，但是后续的sodA靶基因扩增结果均证实为溶血曼氏杆菌。

4 结论

本研究基于溶血曼氏杆菌单拷贝基因sodA建立了ddPCR方法，成功实现了对牛鼻拭子样品中溶血曼氏杆菌的定量分析，为牛养殖场中溶血曼氏杆菌的临床用药治疗和预防提供了重要的技术支持。

参考文献

[1] Snyder E, Credille B. Mannheimia haemolytica and pasteurella multocida in povine respiratory disease: How are they changing in response to efforts to control them[J]. Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice, 2020, 36(2): 253-268.

[2] Holman D B, Timsit E, Amat S, et al. The nasopharyngeal microbiota of beef cattle before and after transport to a feedlot[J]. BMC Microbiol, 2017, 17(1): 70.

[3] Cozens D, Sutherland E, Lauder M, et al. Pathogenic Mannheimia haemolytica invades differentiated bovine airway epithelial cells[J]. Infection And Immunity, 2019, 87(6): e00078-19.

[4] Jaramillo-Arango C J, Hernández-Castro R, Suárez-Güemes F, et al. Characterisation of Mannheimia spp. strains isolated from bovine nasal exudate and factors associated to isolates, in dairy farms in the central valley of mexico[J]. Research Veterinary Science, 2008, 84(1): 7-13.

[5] Herbel S R, Lauzat B, Von Nickisch-Rosenegk M, et al. Species-specific quantification of probiotic lactobacilli in yoghurt by quantitative real-time PCR[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 115(6): 1402-1410.

[6] Jackson S A, Schoeni J L, Vegge C, et al. Improving end-user trust in the quality of commercial probiotic products[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 739.

[7] Klima C L, Zaheer R, Briggs R E, et al. A multiplex PCR assay for molecular capsular serotyping of Mannheimia haemolytica serotypes 1, 2, and 6[J]. Journal of Microbiol Methods, 2017, 139: 155-160.

[8] Guenther S, Schierack P, Grobbel M, et al. Real-time PCR assay for the detection of species of the genus Mannheimia[J]. Journal of Microbiol Methods, 2008, 75(1): 75-80.

[9] 刘立兵, 石蕊寒, 项佳林, 等. 应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分[J]. 肉类研究, 2018, 32(9): 29-34.

[10] Dupas E, Legendre B, Olivier V, et al. Comparison of real-time PCR and droplet digital PCR for the detection of Xylella fastidiosa in plants[J]. Journal of Microbiol Methods. 2019, 162: 86-95.

[11] 李丹, 徐蕾蕊, 魏海燕, 等. 微滴式数字聚合酶链式反应定量检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2021, 33(3): 284-290.

[12] Kishimoto M, Tsuchiaka S, Rahpaya S S, et al. Development of a one-run real-time PCR detection system for pathogens associated with bovine respiratory disease complex[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2017, 79(3): 517-523.

[13] 魏咏新, 马丹, 李丹, 等. 食品中Escherichia coli O157:H7微滴数字PCR绝对定量检测方法的建立[J]. 食品科学, 2020, 41(16): 259-265.

[14] 李丹, 马丹, 李碧鹰, 等. 微滴式数字聚合酶链式反应定量检测水产品中溶藻弧菌[J]. 中国食品卫生杂志, 2019, 31(4): 345-350.

[15] Hansen S J Z, Tang P, Kiefer A, et al. Droplet digital PCR is an improved alternative method for high-quality enumeration of viable probiotic strains[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 10: 3025.

[16] Cattoir V, Lemenand O, Avril J L, et al. The sodA gene as a target for phylogenetic dissection of the genus Haemophilus and accurate identification of human clinical isolates[J]. International Journal Medical Microbiology, 2006, 296(8): 531-540.

[17] Inamoto I, Lo R. A proteomic analysis of the regulon of the NarP two-component regulatory system response regulator in the bovine pathogen Mannheimia haemolytica A1[J]. BMC Research Notes, 2011, 4: 510.

[18] Witte A K, Mester P, Fister S, et al. A Systematic investigation of parameters influencing droplet rain in the Listeria monocytogenes prfA Assay-reduction of ambiguous results in ddPCR[J]. PLoS One, 2016, 11(12): e0168179.

[19] 刘心, 彭清洁, 彭永崇, 等. 牛溶血曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(6): 1131-1135.

[20] 王子杰, 操义恒, 马雪, 等. Beltex羊肺源多杀性巴氏杆菌和溶血曼氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国兽医学报:1-8.

[21] Timsit E, Christensen H, Bareille N, et al.Transmission dynamics of Mannheimia haemolytica in newly-received beef bulls at fattening operations[J]. Veterinary Microbiol, 2013, 161(3-4): 295-304.

[22] Allen J W, Viel L, Bateman K G, et al. The microbial flora of the respiratory tract in feedlot calves: associations between nasopharyngeal and bronchoalveolar lavage cultures[J]. Canadina Journary Veterinary Research, 1991, 55(4): 341-346.

退火温度优化; 1～8: 退火温度分别为62℃、61.6℃、60.8℃、59.7℃、58.3℃、57.2℃、56.4℃、56℃

引物探针浓度优化; 1～3: 上下游引物400 nmol/L和探针200 nmol/L; 4～6: 上下游引物600 nmol/L和探针250 nmol/L; 7～9: 上下游引物900 nmol/L和探针250 nmol/L; 10～12: 上下游引物1200 nmol/L和探针500 nmol/L

图1 （A）退火温度和（B）引物探针浓度优化结果

Fig.1 Optimization of (A) the annealing temperature and (B) the concentration of primer and probe

图4 ddPCR方法灵敏性试验结果

Fig.4 Sensitivity results of ddPCR assay

表1 梯度稀释的溶血曼氏杆菌ddPCR定量检测结果

Table 1 Quantitative detection of gradient diluted pure culture solution of M. haemolyticus

注: 偏差^a=（平均值－理论值）/理论值×100%,以平板计数结果Lg值8.00作为理论值; “—”代表阴性

表2 临床样品ddPCR和qPCR检测结果

Table 2 Detection results of ddPCR and qPCR in clinical samples

注：“—”代表阴性

第一作者：苏征（1979—），男，汉族，山东平度人，硕士，高级工程师，主要从事食品农产品、矿产品检测工作，E-mail: suzh17@163.com

1. 日照海关 日照 276800

2. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部） 青岛 266000

1. Rizhao Customs, Rizhao 276800

2. Qingdao Inernational Travel Healthcare Center (Qingdao Customs Port Outpatient Departments), Qingdao 266000