组织解体黄桃罐头霉菌的生物学特性及控制技术研究-中国口岸科学技术-2023年01期

组织解体黄桃罐头霉菌的生物学特性及控制技术研究

作者：苏征高瑞刚许美玲杨立明卢志晓姜涛相湛昌

苏征高瑞刚许美玲杨立明卢志晓姜涛相湛昌

罐头是我国食品加工业中起步较早的产业，是重要的出口加工食品。水果罐头约占罐头总产量的25%，是罐头产品中的大类，在国内外罐头食品市场颇受欢迎^[1-2]。水果罐头密封使罐内食品与外界隔绝，而不会被微生物污染，经过高温杀菌可使罐内绝大部分微生物死亡，消除了食品变质的主要诱因。但是，近年来也出现了果肉组织软烂解体、甚至糊化变质的现象，有些企业生产的水果罐头储存1个多月就出现了果肉组织的质量问题。据统计，全国有上百家罐头生产企业出现过该类质量问题，造成的直接经济损失达数千万元，成为当前制约我国水果罐头加工的一道难题。

罐头食品虽经过杀菌处理，但仍然可能有腐败微生物存在，这是由于杀菌不足，或在杀菌后罐头密封不良而受到来自外界的污染。罐头食品中污染或残留的腐败微生物能够引起罐头食品变质，变质的特性如何由多种因素所决定。目前，国内对水果罐头组织解体的系统研究报道较少，主要见于对罐头发生胀罐、浑浊等现象发生原因的研究^[3-5]。有些水果罐头加工企业在生产过程中，为保持罐头的色泽、口感和客户要求的产品品质，根据生产经验调整水果罐头的杀菌温度、杀菌时间等关键参数^[6]。因没有验证杀菌参数或仅经简单验证后即投入大规模生产，同时缺乏理论依据和科学规范的数据支持，不当杀菌造成产品污染给企业造成重大损失。据此，本研究对组织解体黄桃罐头所分离的病原菌的主要生物学特性进行研究^[7-9]，通过实验室和生产线验证，旨在对水果罐头中的污染微生物进行分析并探索控制措施，降低微生物污染率，以期为黄桃罐头组织解体的原因探讨和改进生产工艺提供理论依据，以及为制定相应的控制措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

黄桃罐头来源于工厂发生果肉组织解体的腐败变质的样品及当季生产的样品。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、疱肉琼脂培养基、麦芽浸膏琼脂培养基、AC琼脂培养基、硫乙醇酸钠琼脂培养基、嗜热耐酸芽孢杆菌培养基、锰盐营养琼脂、麦芽浸粉琼脂培养基、卵黄琼脂基础、孟加拉红琼脂培养基^[2]。

1.2 主要仪器

MOS-3020高压灭菌锅，日本三洋电子有限公司；MIR-253生化培养箱，日本三洋电子有限公司；PHOENIX 100微生物鉴定仪，美国BD设备有限公司；BX41 OLYMPUS生物显微镜，日本奥林巴斯公司；冷却及杀菌装置为工厂自制。

1.3 试验方法

1.3.1 腐败菌分离和鉴定

采用增菌培养的方法，对组织解体黄桃罐头微生物进行分离、培养^[2,10]。

1.3.2 生物学特性研究

（1）培养基的影响。供试验培养基11种，包括PDA培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、疱肉琼脂培养基、麦芽浸膏琼脂培养基、AC琼脂培养基、硫乙醇酸钠琼脂培养基、嗜热耐酸芽孢杆菌培养基、锰盐营养琼脂、麦芽浸粉琼脂培养基、卵黄琼脂基础、孟加拉红琼脂培养基，移植直径5 mm的菌饼，35℃培养8 d；24 h后采用十字交叉法测定菌落直径。试验设3次重复。

（2）pH值的影响。用浓度为0.1%的NaOH和浓度为0.1%的HCl溶液调节PDA培养基的pH值，使其分别为2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9和10，共计11个pH值。将5 mm的菌饼放置培养基上，35℃培养8 d，每个pH值做3个重复。菌落直径测定方法见（1）。

（3）温度的影响。分别设置培养箱4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、38℃、40℃、50℃、53.5℃、55℃和60℃共13个温度，移植直径5 mm的菌饼于PDA培养基上进行培养。每个温度设置3个重复。菌落直径测定方法见（1）。

（4）菌丝致死温度测定。分别设置恒温水浴锅47℃、50℃、53.5℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃ 9个温度，将直径5 mm菌饼置于装有5 mL无菌水的试管中，恒温水浴处理10 min（预热1 min后开始计时）后迅速冷却，放置3块菌饼于PDA培养基表面，35℃培养。每个处理温度设置3个重复。培养48 h后根据菌丝生长状况确定菌丝致死温度。

1.3.3 菌种回接试验

（1）孢子悬浮液的制备。将纯菌种培养在PDA培养基上，在35℃培养15 d；向培养皿中加入含0.05 g十二烷基硫酸钠的水溶液10 mL，用无菌镍铬丝在菌种表面轻刮；将孢子提取液注入125 mL带盖锥形瓶，瓶内装有45 mL水和实心玻璃球；锥形瓶置于摇床上，剧烈震荡锥形瓶使孢子块破碎并从菌丝体中释放孢子出来；用装有6 mm厚玻璃棉的玻璃漏斗，将霉菌孢子悬浮液过滤到锥形瓶中，以除去大的菌丝体碎片和琼脂块；将过滤后的孢子悬浮液离心，弃掉上层液；在剩余物加入50 mL水重新悬浮并离心。将获得的霉菌孢子离心3次至上清液变澄清；稀释得到的离心沉淀物，在显微镜下计数，最终得到的孢子悬浮液中含有10⁵ CFU/mL和10³ CFU/mL个孢子，备用。

（2）接种方法。①杀菌后接种。在无菌室内，将霉菌孢子液1 mL加入至正常条件下生产完毕的罐头样品中，采用蒸汽法对罐头进行封口，保证其不受外界环境的污染。②杀菌前接种。将去核去皮处理完毕的黄桃原料用无菌水冲洗干净，并对其表面进行清理，罐头装罐后加汤前，将试样移至无菌室尽快进行接种。接种高浓度的菌种，即10⁵ CFU/mL；静置2 h后，送回车间进行加汤、封口、杀菌、冷却，除对试样采取接种处理外，其他条件与生产线上的对照产品一致。

（3）回接试验。选取4家罐头生产企业进行验证试验，分离的3种菌株每个浓度接种12个样品，罐瓶容量重为500 g。H表示高浓度菌种，L代表低浓度菌种，数字1～12分别表示12个重复，同时设置未接种菌株的同批次样品作为对照试验。将试验样品置于恒温30℃观察室内，定期观察容器外观和内容物形状有无变化，抽取部分样品开罐检查其真空度、形态、色泽、pH值等项目^[11]，观察30 d。按照（2）中①的方法，对可能引起水果罐头组织解体变质的霉菌进行实验室回接验证试验，检查是否引起罐头腐败现象；按照（2）中②的方法，灭菌前回接霉菌以探索杀菌条件。

1.3.4 杀菌控制技术研究

对杀菌后回接霉菌的样品，根据所接种菌株的特性，调整杀菌温度，使罐内温度达到灭菌效果。通过试验研究冷却方式、冷却时间、罐内压力、罐内壁温度、罐中心温度的情况，探索杀菌公式和冷却方式。

2 结果与分析

2.1 腐败菌鉴定

从发生组织解体的黄桃罐头中分离出3株霉菌，编号分别为15-1、17-1和2802。查阅《真菌鉴定手册》^[12]、《真菌的形态和分类》^[13]等相关鉴定文献，结合BD微生物鉴定仪和rDNA-ITS序列分析，15-1与Aspergillus terreus相似性为99%，17-1与Penicillum chrvsogenum相似性为100%，2802与Fusarium solani相似性为99%，综合鉴定结果表明，腐败黄桃罐头中分离得到的霉菌为Aspergillus terreus（土曲霉）、Penicillum chrvsogenum（青霉属）、Fusarium solani（腐皮镰孢）。3种菌株经中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）鉴定、编号并保存，可供查询使用。

2.2 生物学特性

2.2.1 培养基的影响

对17-1菌株，最适合生长的培养基是PDA，其次分别是溴甲酚紫葡萄糖琼脂和嗜热耐酸芽孢杆菌培养基；对于15-1菌株，最适合生长的培养基是溴甲酚紫葡萄糖琼脂，其次是疱肉琼脂培养基和卵黄琼脂基础；对2802菌株，最适合生长的培养基是卵黄琼脂基础培养基、疱肉琼脂培养基和PDA培养基，如图1所示。因此，PDA培养基、卵黄琼脂基础、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、疱肉琼脂培养基是培养罐头中分离的3株霉菌较好的培养基。

A: PDA培养基; B: 疱肉琼脂培养基; C: 溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基; D: 水琼脂; E: 硫乙醇酸钠琼脂培养基; F: AC琼脂培养基; G: 嗜热耐酸芽孢培养基; H: 麦芽浸粉琼脂; I: 锰盐营养琼脂; J: 卵黄琼脂基础; K: 孟加拉红琼脂

图1 不同培养基对霉菌生长的影响

Fig.1 Effects of different culture media on growth of moulds

2.2.2 pH值对霉菌生长的影响

pH值是影响腐败微生物生长繁殖的重要因素。通常以pH值把罐头食品分为3类：pH值4.5以上为低酸性，pH值4.0～4.5为酸性，pH值4.0以下为高酸性^[14]。黄桃罐头属高酸性食品，一般pH值在3.4～4.0之间。在pH值3.5～10的范围内，3株霉菌均能生长。从图2可以看出，17-1菌株在pH值为7～9时生长最好，15-1菌株在pH值7时生长最好，2802菌株在pH值9时生长最好。由此可以看出，所分离的3株霉菌在弱碱性环境中生长最好。水果罐头为高酸性食品，霉菌的耐酸性较强，其中17-1菌株在pH值为2.5时能生长，在培养基表面形成一层白色菌丝膜，而其余2种霉菌在pH值为3时不能生长。在pH值为3.5时，15-1和2802菌株能生长，由于培养基在低pH值时不能凝固，因此没有测量其生长直径。

图2 pH值对霉菌生长的影响

Fig.2 Effects of pH on growth of moulds

2.2.3 温度的影响

通过观察不同温度下培养情况可以看到，在15～38℃范围内，霉菌菌丝均可生长，其中25～38℃为适宜生长的温度范围，菌丝生长较为致密，其他温度下菌丝较为稀疏；最适生长温度为35℃，低于10℃和高于45℃时均不生长。

2.2.4 确定致死温度

将经过温度处理过的霉菌在35℃下培养，结果发现，经≥58℃处理后，17-1菌株不能生长；15-1菌株在≥55℃处理后，菌丝未生长；经≥53.5℃处理后，2802菌株未生长。因此，处理时间为10 min 时，17-1菌株的致死温度为58℃，15-1菌株的致死温度为55℃，2802菌株的致死温度为53.5℃。

2.3 菌种回接结果

通过持续观察试验发现，杀菌后回接霉菌，回接的3株霉菌均能引起黄桃罐头组织解体（图3）。经镜检形态特征鉴定，与回接的3种霉菌一致，因此证实所分离的3株霉菌为导致黄桃罐头发生组织解体的主要腐败菌。接种17-1菌株和2802菌株1周后，罐头发生胀罐，继续观察3 d后，胀罐现象消失。推断在接种后与罐头内容物发生化学反应，产生气体，观察到胀罐现象，反应一段时间后，气体消失，胀罐现象消失。

图3 杀菌后接种霉菌的黄桃罐头

Fig.3 Canned yellow peach inoculated with mould after sterilization

对按照1.3.3（2）接种方法②所述方法杀菌前回接霉菌的样品，采用改良的杀菌温度和冷却方式进行灭菌处理，观察期结束后，对样品开罐检验，固体物形态正常、色泽鲜亮，真空度、pH值、糖度等检测项目均在正常范围内，未发生组织解体现象。

2.4 杀菌模式探讨

根据能够造成黄桃罐头组织解体目标菌的生长温度调整杀菌公式，经试验发现，设置初温40℃、16 min/98℃和初温40℃、20 min/95℃两种条件对接种霉菌的罐头杀菌后，经商业无菌检验合格，满足罐头的生产要求。对杀菌后冷却方式进行调整，梯度分段冷却方法对水果罐头具有较好的效果，既能达到冷却水果罐头的目的，又能防止冷却水内吸现象。经过水果罐头加工企业生产线验证发现，采用60℃一次冷却5 min，20℃二次冷却25 min，即二次冷却的方法，效果较好。经此方法处理的罐头不仅具有较好的杀菌效果，而且能够保持罐头具有良好的色泽和风味。经过20个月的货架期后未发现组织解体现象。杀菌模式初探为实际生产中的杀菌处理提供了理论基础。

水果罐头中微生物繁殖产生果胶酶，果肉连接相邻细胞壁的中胶层内果胶分解致罐内水果组织解体^[15]。因此，应找到黄桃罐头的适宜杀菌条件，既能在生产阶段将霉菌杀灭，又能保持罐内水果形态、色泽、口感的最佳状态。设置较高的杀菌温度，较短的杀菌时间罐内中心温度即可达到灭菌的条件。若设置的温度太高，则不利于保持罐头较好的色泽和口感；而温度太低则不能满足杀菌要求，不能有效灭菌。根据3株霉菌的特性，在生产线上设置适合的杀菌温度和时间，通过检测杀菌温度和冷却时间对黄桃罐头罐内温度（罐内壁温度、中心温度）、压力的影响，采用分段冷却的方法解决水果罐头冷却和防止冷却水内吸这两个关键问题，同时满足水果罐头的货架要求。

3 结语

生物学特性试验结果表明，不同的培养基、温度、pH值等条件对所分离到的霉菌生长有影响。在pH值3.5～10、15～38℃的范围内都能生长，适应范围较广，其中17-1菌株在pH值 2.5时生长良好，耐酸性较强。在黄桃罐头的酸性环境中，3株霉菌均能正常生长，是合适的生长pH值条件。17-1菌株、15-1菌株和2802菌株的致死温度分别为58℃、55℃和53.5℃，10 min。通过大量不同培养基的使用，以及不同pH值、不同培养温度等条件的实验，确定了其最佳生长条件及致死温度，为水果罐头标准的制修订及杀菌温度的改进提供了理论依据。

微生物繁殖是导致罐头变质的主要原因之一。反证试验表明3个菌株能引起罐头的组织解体现象。水果罐头的加工工艺包括选果、原料处理、挑选、装罐、称量、浇汤、封口、杀菌、冷却、半成品入库等阶段。原料进场后挑拣去除果肉软化的过熟果、腐烂果，使用流动清洁水冲洗处理后的原料，加工过程中合理安排各工序员工数量，确保原料从进厂开始到封口杀菌的时间不超过2 h。杀菌和冷却过程是防止微生物污染的最后一道防线，因此合适的杀菌温度和冷却方式非常重要。经过4个生产厂家、300多罐次验证，提出的杀菌公式和分段冷却的方法具有可重复性、可靠性，本研究对水果罐头生产过程中的杀菌参数优化、产品发生非商业无菌时微生物的检测及产品变质原因分析具有一定借鉴作用。

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