尹文秀 陈哲 虞惠贞 张荃 应正平 吴姗 张晓峰 张明哲

Abstract Cibotium barmetz (L.) J. Sm. is listed in Appendix II of the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES), and also in the List of National Key Protected Wild Plants, with a protection level of Class II, which is a kind of rare and endangered plant. In this paper, Cibotium barometz and its confusable species were distinguished by the morphological characteristics of roots, leaves and sori, etc. The results showed that the mat-like golden hairy and dog-head shaped plant base, the leaves with small lanceolate pinna and falcate lobes on both sides, as well as 1 to 5 pairs of sori were the typical identification characteristics of Cibotium barometz. However, for samples without typical identification forms, DNA barcoding was an accurate and reliable identification method and an effective supplement to traditional morphological identification methods. For this reason, this paper selected the general primers psbA-trnH and trnl to amplify and sequence two suspected Cibotium barometz samples, and the results showed that both samples were Cibotium barmetz. In this study, an accurate and reliable morphological and molecular biological method for the identification of Cibotium barometz was established, which provided an important reference for the identification of Cibotium barometz.

Keywords Cibotium barometz ; DNA barcoding; identification

金毛狗（Cibotium barometz (L.) J. Sm.），又称金毛狗蕨、金毛狗脊，隶属于金毛狗蕨科（Cibotiaceae）金毛狗属（Cibotium）植物^[1-2]，已被列入CITES（2023年2月23日生效）附录Ⅱ中，并且金毛狗属（所有种）（Cibotium spp.）列入《国家重点保护野生植物名录》（2021年8月7日经国务院批准）二级保护级别。金毛狗属植物约20种，分布于热带东南亚至大洋洲、夏威夷及中部美洲，我国仅有1种，即金毛狗^[1,3]，生长于山麓沟边及林下阴处酸性土上，印度、缅甸、泰国、印度尼西亚等都有分布。金毛狗根状茎卧生，粗大，顶端生一大叶，柄长可达120 cm，呈棕褐色，基部被有一大丛垫状的金黄色茸毛，有光泽并且上部光滑；叶片大呈广卵状三角形，三回羽状分裂；叶片互生，叶几为革质或厚纸质，孢子囊生于下部的小脉顶端，囊羣盖坚硬为棕褐色，孢子为三角状的四面形，呈透明状^[1]。

金毛狗是一种常用的传统药用植物^[4]。其根状茎顶端的长软毛可作为止血剂，干燥根茎即中药狗脊具有祛风湿、补肝肾、强腰膝等功效，用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、下肢无力等症状^[5]。学者们对其药用价值研究较为普遍^[6-10]。此外，伍莲等对金毛狗形态多样性分化及群落特征、金毛狗居群遗传多样性进行了研究^[11-14] ；刘光华等^[15]对金毛狗孢子体的显微结构进行了研究；吴琦、许重远等对金毛狗的化学成分及药理活性进行了研究^[4,16-19]。但关于金毛狗鉴定方法的研究尚未见报道。

近年来，多采用分子生物学方法进行物种鉴定，该方法因其简便、快速、准确等特点得到广泛使用^[20]。DNA条形码技术（DNA barcoding）是利用标准的一个或多个DNA片段进行物种鉴定及探索其亲缘进化关系的方法，此方法不受个体形态、大小等特征和完整性的影响，避免了形态学鉴定中存在的局限性，能直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据，可有效区分种间差异^[21]。本研究基于DNA条形码技术鉴定珍稀濒危植物金毛狗，以期为其进一步的研究与开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品为浙江省某单位于执法过程中查获的2株盆栽植物（图1、图2），分别编号为样品1和样品2。

1.2 形态学方法

金毛狗的根、茎、叶、孢子囊群、孢子等形态特征是区分其与易混种的主要依据，可通过肉眼或借助放大镜观察其生物学特征进行初步鉴别。对于植株形态特征不明显或不完整的，可进一步结合分子生物学方法进行辅助判定。

1.3 分子生物学方法

1.3.1 DNA提取

采用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）试剂盒提取DNA。剪取少量植物叶片，清洗后将植物叶片研磨成细粉，后参照试剂盒说明书操作。提取前按照试剂盒的要求，先将Qiagen试剂盒中的Buffer AP1置于65℃水浴锅中预热。

1.3.2 引物

通过筛选确定通用引物psbA-trnH和trnl，对样品进行扩增。引物由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成，引物序列见表1。

1.3.3 PCR扩增和测序

PCR扩增体系为20 μL：2×Phanta Max Master Mix 10 μL，引物各0.4 μL（20 μmol/L），DNA模板2 μL（10～30 ng/μL），ddH₂O 7.2 μL。扩增程序：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，57℃退火15 s，72℃延伸15 s，40个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物经纯化后，送至测序公司进行双向测序。

2 结果与分析

2.1 金毛狗及其易混种形态区分

金毛狗与欧洲蕨、毛蕨、珠芽狗脊形态特征的区分比较见表2，通过这几种植物根、叶、孢子囊群的不同特征可对其进行区分。

通过样品的根和叶片初步判定送检样品为蕨类植物，但样品形态不完整，无法鉴定具体科属种。根据样品根部金黄色茸毛（图1），猜测样品可能为金毛狗，故对金毛狗及其易混种的形态进行区分。金毛狗与其易混种典型的形态区分特征为：基部被垫状金黄色茸毛，形状如狗头；小羽片披针形；两侧裂片镰刀形；孢子囊群1～5对等。从样品的根部及叶片形态，可初步判定样品为金毛狗（Cibotium barometz (L.) J. Sm.）。但样品形态不完整，不能完全确定植物种属，需要采用DNA分子条形码技术对样品进行精准判定。

图1 样品1（左）和样品2（右）植物根部

Fig.1 Plant roots of Sample 1 (left) and Sample 2 (right)

图2 样品1（左）和样品2（右）的植物叶片

Fig.2 Plant leaves of Sample 1 (left) and Sample 2 (right)

图3 欧洲蕨的形态

Fig.3 Morphology of Pteridium aquilinum

图4 欧洲蕨的叶

Fig.4 Leaves of Pteridium aquilinum

图5 毛蕨的叶

Fig.5 Leaves of Cyclosorus interruptus

图6 毛蕨孢子囊群

Fig.6 Sorus of Cyclosorus interruptus

图7 珠芽狗脊的叶

Fig.7 Leaves of Woodwardia prolifera

图8 珠芽狗脊孢子囊群

Fig.8 Sorus of Woodwardia prolifera

2.2 psbA-trnH和trnl引物序列扩增结果

以提取未知样品的DNA为模板进行PCR扩增，其产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，psbA-trnH序列扩增长度在500～600 bp之间，与阳性对照长度一致，阴性对照与空白对照相应位置上无任何扩增条带（图9）；trnl序列扩增长度在400～500 bp之间，与阳性对照长度一致，阴性对照与空白对照相应位置上无任何扩增条带（图10），各泳道目的条带特异性好，丰度高。

N: 阴性对照; B: 空白对照; P: 阳性对照; 1: 样品1; 2: 样品1；3: 样品2; 4: 样品2; Mark: 核酸分子标记DL5000

图9 样品1和样品2的psbA-trnH引物序列扩增结果

Fig.9 Results of psbA-trnH primer sequence amplification of Sample 1 and Sample 2

N: 阴性对照; B:空白对照; P:阳性对照; 1:样品1; 2:样品1; 3:样品2; 4:样品2; Mark:核酸分子标记DL5000

图10 样品1和样品2的trnl引物序列扩增结果

Fig.10 Results of trnl primer sequence amplification of

Sample 1 and Sample 2

2.3 序列比对结果分析

对PCR产物进行测序，利用SeqMan软件对样品1和样品2的psbA-trnH序列和trnl序列进行拼接，拼接结果如图11、图13、图15和图17所示。登录美国国家生物信息中心进行序列同源性比较分析，数据库比对结果见图12、图14、图16和图18。对于样品1，通过psbA-trnH引物PCR扩增得到长度为527 bp的DNA片段，经过测序和BLAST比对，发现该片段与金毛狗psbA-trnH基因（GenBank号：MN629913.1）的同源性为100%（图12）；通过trnl引物PCR扩增得到长度为418 bp的DNA片段，经过测序和BLAST比对，该片段与金毛狗trnl基因（GenBank号：KY858892.1）的同源性为99.04%（图14）。

对于样品2，通过psbA-trnH引物PCR扩增得到长度为529 bp的DNA片段，测序和BLAST比对结果显示，该片段与金毛狗psbA-trnH基因（GenBank号：MN629913.1）的同源性为99.61%（图16）；通过trnl引物PCR扩增得到长度为417 bp的片段，经过测序和BLAST比对，发现该片段与金毛狗trnl基因（GenBank号：JX485682.1）的同源性为99.25%（图18）。

上述结果表明，植物样品1和植物样品2通过psbA-trnH序列和trnl序列比对同源性最高的物种均为金毛狗。

3 讨论与结论

在植物鉴定过程中，经常会遇到样品形态缺失的情况，诸如只有种子、叶片或果实等情形，这种情况下难以对未知植物进行形态鉴定，DNA条形码技术正是解决这些问题的突破技术。从分子遗传学角度来看，物种表现型（形态、微观解剖构造等）的差异归根到底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异，DNA条形码正是DNA序列差异的特征片段。DNA条形码是生物体内能够代表该物种的，有足够变异且可以区分不同物种的DNA短片段，该技术通过使用较短的基因片段实现物种的准确识别。目前DNA条形码技术在动植物物种鉴定领域已得到广泛应用，是传统鉴定方法的有效补充，此方法避免了形态学鉴定中存在的局限性，能直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据。

本研究通过对送检2株盆栽植物进行DNA条形码鉴定，选取psbA-trnH和trnl两对引物对样品进行扩增，并对PCR产物测序，结果经BLAST比对，分析序列比对结果并确定样品名称，再结合样品形态进行综合判定，最终判定送检样品为金毛狗植物。对于金毛狗植物形态的判定，要注意与易混种欧洲蕨、毛蕨、珠芽狗脊的区分。主要通过植物基部被垫状金黄色茸毛，形状如狗头；小羽片披针形；两侧裂片镰刀形；孢子囊群1～5对等典型特征对金毛狗加以区分。有学者对金毛狗居群个体的叶片、羽片、根状茎等41项形态特征进行研究，结果表明金毛狗的形态特征在居群内呈现小聚类群分化现象，在亚表征群水平出现明显的个体分化现象，在更小的距离上个体分化现象更加明显^[24]。所以形态学和分子生物学方法可互为佐证。

金毛狗植物经济价值巨大，不法分子为谋求私利不断私挖乱采，加上植株根系不发达、自然更新效率低、环境适应能力较差等原因，导致金毛狗野生种群和个体数量急剧下降。为保护金毛狗种群的生长和正常繁殖，建议当地政府和国家相关部门加大对其分布区的监管力度，严禁采挖，使金毛狗野生种群能够恢复到大居群状态。同时，在保护好野生资源的基础上探索出实现金毛狗优质高产的繁殖方式，最终实现对金毛狗脊资源的可持续利用。

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表1 psbA-trnH和trnl的引物序列

Table 1 Sequences of psbA-trnH and trnl

表2 金毛狗及其易混种的形态特征

Table 2 Morphological characteristics of Cibotium barometz and its easily mixed species

图11 样品1的psbA-trnH基因扩增序列

Fig.11 The amplified sequence of psbA-trnH gene of Sample 1

图12 样品1的psbA-trnH基因扩增序列在GenBank数据库中的比对结果

Fig.12 Comparison results of the amplified sequence of psbA-trnH gene of Sample 1 in GenBank database

图13 样品2的psbA-trnH基因扩增序列

Fig.13 The amplified sequence of psbA-trnH gene of Sample 2

图14 样品2的psbA-trnH基因扩增序列在GenBank数据库中的比对结果

Fig.14 Comparison results of the amplified sequence of psbA-trnH gene of Sample 2 in GenBank database

图15 样品1的trnl基因扩增序列

Fig.15 The amplified sequence of trnl gene of Sample 1

图16 样品1的trnl基因扩增序列在GenBank数据库中的比对结果

Fig.16 Comparison results of the amplified sequence of trnl gene of Sample 1 in GenBank database

图17 样品2的trnl基因扩增序列

Fig.17 The amplified sequence of trnl gene of Sample 2

图18 样品2的trnl基因扩增序列在GenBank数据库中的比对结果

Fig.18 Comparison results of the amplified sequence of trnl gene of Sample 2 in GenBank database