谭建锡 胡忆文 禹思宇 李桐菲 安家雯 唐连飞

近年来，野生动物及其制品非法贸易猖獗，给野生动物的生存带来严重威胁，其中针对熊科动物的皮毛、熊胆和身体部位（掌、爪、牙等）的走私和非法交易更是屡禁不止^[1-2]。亚洲黑熊是世界自然保护联盟（International Union for Conservation of Nature，IUCN）发布的濒危物种红色名录中的近危物种，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅰ，属于我国《国家重点保护野生动物名录》中的二级保护动物。在海关旅邮检和缉私查获的熊制品中，以熊胆等熊制品最为常见。为逃避监管，一些不法分子常对熊胆进行炮制加工，或将其瞒报或伪报为牛胆、猪胆等，仅从形态学上难以进行准确判断，给海关执法工作带来了挑战。

目前对于野生动物及其制品的鉴定，形态学鉴定技术是最传统、最基础的鉴定方法。但在实际鉴定工作中，许多检材因存在相近的鉴别特征或已缺失整体形态学特征而不易辨认^[3]。为解决野生动物及其制品在形态学物种鉴定上的难题，研究者们开发了基于遗传物质DNA的分子学物种鉴定技术，主要有DNA条形码、物种特异性PCR、PCR-RFLP、实时荧光PCR等^[4-6]。在濒危动物鉴定中，以针对线粒体COⅠ基因的DNA条形码技术使用较为广泛。细胞色素c氧化酶亚基（Mitochondria cytochrome coxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因是位于线粒体上的一段基因片段，在生物种群中的某些遗传保守性很强，又存在较大的DNA片段差异性，扩增区域变异程度足以区分不同物种。当前针对熊及其制品DNA的相关研究中，主要集中在利用微卫星标记、荧光PCR技术等对熊胆成分、熊类源性成分检测等方面^[7-8]。

本研究从分子生物学层面，利用普通PCR和荧光PCR技术，并借助DNA条形码分析方法，比较亚洲黑熊和棕熊与常见伪瞒报品的COⅠ序列差异，探讨基于COⅠ基因建立应用于熊类制品鉴定的可行性方法，为打击熊类制品走私和非法交易提供技术支撑，并为濒危野生动物保护和科研工作提供一定参考。

1 材料

供试样品为熊胆粉，由归真堂药业股份有限公司提供。亚洲黑熊Ursus thibetanus各地理亚种（指名亚种Ursus thibetanus thibetanus、东北亚种Ursus thibetanus ussuricus、四川亚种Ursus thibetanus mupinensis、喜马拉雅亚种Ursus thibetanus laniger、台湾黑熊Ursus thibetanus formosanus、日本黑熊Ursus thibetanus japonicus）、棕熊Ursus arctos、美国黑熊Ursus americanus、北极熊Ursus maritimus和常见伪瞒报品牛Bos taurus、猪Sus scrofa、羊Ovis aries等共21条CO Ⅰ序列来源于GenBank（表1）。

表1 亚洲黑熊、棕熊等物种COⅠ序列信息

Table 1 COⅠ sequence information of Ursus thibetanus,

U. arctos and other species

2 方法

2.1 核酸提取与纯化

利用QIAamp DNA提取试剂盒进行样品DNA提取。提取方法作出如下改进：称取粉末状样本至1.5 mL离心管中，置于金属浴中，设置温度为65℃、转速为900 r/min进行充分振荡混匀；之后按提取试剂盒说明书的要求进行后续核酸抽提操作；最后，加入TE Buffer进行洗脱，得到DNA溶液，于-20℃冰箱中保存、备用。

2.2 普通PCR扩增

根据已报道近缘物种基因序列筛选引物，参考线粒体控制区序列，结合脊椎动物的COⅠ基因的保守区，选择使用通用引物MCOI-F/MCOI-R进行核酸PCR扩增^[9]，引物序列为MCOI-F：5'-CAACAAATCACAAAGACATCGG-3'；MCOI-R：5'-TTCTGGGTGTCCGAAAAATCA-3'。参考已有文献建立的熊源特异性引物及探针进行荧光PCR扩增^[10]，引物、探针序列为F：5'-CTGACTGCTGCCACCATCTTT-3'；R：5'-CAGTTCCTGCACCTGCTTCTACTATAG-3'；P：5'- (FAM) TGTTGCTTCTAGCTTCT (MGB) -3'。以上引物及探针均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

扩增体系与条件：PCR总反应扩增体系为25.0 μL，其中2×Green Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 5.0 μL，补水至25 μL。反应程序：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，50℃ 60 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃延伸10 min。

扩增产物电泳分析及数据处理：PCR扩增反应结束后，取5 μL PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳上点样，90 V电压下电泳30 min后进行凝胶成像系统分析。将合格的扩增目的条带进行纯化回收后，送上海生工生物工程技术服务有限公司（Sangon）进行测序。

2.3 荧光PCR扩增

荧光PCR检测方法扩增反应体系与条件：Probes qPCR Master mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL、10 μmol/L探针0.5 μL，模板DNA 5.0 μL，用水将总体积补足至25 μL。反应程序：94℃预变性2 min；94℃变性10 s，60℃退火延伸60 s，40个循环；在第二阶段的退火延伸（60℃）时段收集荧光信号。反应结束后，比较并分析荧光PCR扩增效果。

2.4 数据分析

将所得测序序列（MCOI-F）拼接、核对后，去除引物区后，同NCBI网站GenBank数据库中已有序列进行BLAST比对，确认获得序列为目的序列。使用MEGA 5.0软件将实验测序获得样本COⅠ序列同GenBank中来源的亚洲黑熊其他亚种、棕熊及常见伪瞒报品等物种的COⅠ序列进行分析比对以获得变异位点，并利用邻接（Neighbor Joining，NJ）法构建熊科物种COⅠ基因系统发育树。利用DNAStar软件中的MegAlign进行亚洲黑熊种内序列同源性分析。

3 结果与分析

3.1 普通PCR扩增

以通用型引物MCOI-F/MCOI-R进行PCR扩增，将产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，发现以样品DNA为模板直接扩增后的产物条带比较微弱（图1），无法用于核酸序列测定。实验采取以产物为模板进行二次扩增后，其条带亮度显著增加（图1），可用于序列测定。

M: DNA Marker ; 1 : 阳性对照; 2 、5: 第一次PCR扩增产物; 3～4: 空白对照; 6: 第二次PCR扩增产物

图1 样品COⅠ基因扩增结果

Fig.1 Results of the COⅠgene amplification in samples

3.2 序列分析与同源性比对

为确保所获得目的黑熊COⅠ序列的准确性，将测序序列经软件拼接、核对后，与NCBI网站的GenBank数据库中已有序列进行BLAST分析。结果显示，本实验所提取的DNA扩增产物测序序列与NCBI网站中亚洲黑熊Ursus thibetanus线粒体基因组序列最高的同源性为98.96%（图2）。

3.3 荧光PCR扩增

荧光PCR扩增出现典型扩增曲线，阈值循环数（Cycle threshold，Ct）约为32（图3），说明所供试样品中含有熊源性成分。

P: 阳性对照; S1、S2: 样品; N: 实验对照

图3 样品荧光PCR扩增结果

Fig.3 Fluorescent PCR amplification results of samples

3.4 遗传距离及变异位点分析

亚洲黑熊种内序列比对结果显示，该编码区平均GC含量低于50%，在45.11%～46.37%之间，并发现31个变异位点（表2）。亚洲黑熊COⅠ序列种内平均遗传距离为0.0184，种内最大遗传距离为0.0411；亚洲黑熊与棕熊平均遗传距离为0.1028，最小遗传距离为0.0860；亚洲黑熊与伪瞒报品（牛、猪、羊等）平均遗传距离为0.3171，最小遗传距离为0.2921；棕熊与伪瞒报品平均遗传距离为0.7715，最小遗传距离为0.6398。见表3。

表3 亚洲黑熊、棕熊及常见伪瞒报品遗传距离分析

Table 3 Genetic distance analysis of Ursus thibetanus,

U. arctos and common false declaration products

3.5 亚洲黑熊、棕熊及常见伪瞒报品系统发育树分析

基于亚洲黑熊、棕熊及常见伪瞒报品等物种COⅠ序列构建系统发育树并分析，发现其遗传分化明显，亚洲黑熊单独聚为一小簇（a），棕熊聚为一大簇（b），常见伪瞒报品牛、猪、羊等各单独聚为一簇且区分明显（c），表明构建系统发育树可明显区分亚洲黑熊、棕熊及常见伪瞒报品（图4）。

a : 亚洲黑熊; b : 棕熊; c : 牛、猪、羊

图4 亚洲黑熊、棕熊及常见伪瞒报品COⅠ序列系统发育树

Fig.4 Construction of NJ tree based on COⅠ sequence of Ursus thibetanus, U. arctos and common false decalration

products

经进一步对亚洲黑熊各亚种COⅠ序列构建系统发育树进行分析发现，在各个亚种分支中，其与亚洲黑熊指名亚种Ursus thibetanus thibetanus距离最近（图5）。通过亚洲黑熊种内同源性分析，发现本实验获得COⅠ序列与Ursus thibetanus thibetanus同源性为99.2%（图6）。

图5 基于亚洲黑熊种内各亚种COⅠ序列构建系统发育树

Fig.5 Construction of NJ phylogenetic tree based on COⅠ sequence of each subspecies in Ursus thibetanus

1. 0007_(M6)_MCOI-F; 2. Ursus thibetanus MG255811; 3. Ursus thibetanus thibetanus EF587265; 4. Ursus thibetanus formosanus EF076773; 5. Ursus thibetanus japonicus AB863014; 6. Ursus thibetanus laniger MN935768; 7. Ursus thibetanus mupinensis NC008753.

图6 亚洲黑熊种内同源性分析

Fig.6 Intraspecific homology analysis of Ursus thibetanus

4 讨论

近年来基于COⅠ基因发展的DNA条形码技术，因其操作简便、通用性好、准确性高，已被广泛应用于动物起源进化、亲缘关系、遗传变异等方面的研究^[11]。在物种鉴定和生物多样性研究方面也具有广阔的应用前景，并被成功应用到犀牛、赛加羚羊、穿山甲、麋鹿等濒危动物的鉴定中^[12-14]。黑熊是我国二级保护动物，熊胆制品主要来自饲养基地，对其鉴定工作主要是区分牛、猪、羊等常见伪瞒报品。本研究通过样品DNA提取、COⅠ序列PCR扩增、荧光PCR方法，并结合对所构建系统发育树、遗传距离等的分析，对以上方法应用于熊胆制品鉴定进行了初步探讨。

在分子生物学方法层面，针对普通PCR扩增条带较弱而导致的漏检风险，可采取以产物为模板进行二次扩增的方法来增加产物浓度。但该操作较易产生非特异扩增，且在实际应用中也会增加气溶胶污染的风险。有研究建立了荧光PCR方法，并分别以倍比稀释后的熊源性DNA，以及棕熊、黑熊、马来熊、牛、猪等DNA为模板进行单独荧光PCR扩增，验证了所建立方法的良好灵敏度和特异性^[10]，可在一定程度上作为普通PCR扩增验证手段。测序获得的序列可与数据库（NCBI、BOLD等）进行比对，确定该物种的鉴定信息或是进行聚类分析后获得该物种的进化情况。DNA条形码应满足种内变异足够小和种间变异足够明显的要求，体现在遗传距离上则是应满足最大种内差异应小于最小种间差异^[15]，可为后续规范化、标准化濒危物种分类鉴定程序的建立提供一定的参考。

本研究发现高效的DNA提取是物种鉴定的难点，尤其是深加工处理或保存时间久远的制品。后续可对传统或常规试剂盒提取过程中裂解、浓缩等环节进行改进和优化，以提升目标核酸含量和纯度，从而尽可能减少复杂成分对后续PCR扩增的干扰。

DNA条形码技术在物种鉴定方面，未来随着更新一代测序技术的发展，以及更多的新兴鉴定技术，如微型条形码、多位点宏条形码等的开发应用，将为打击濒危野生动物走私和非法贸易提供更强有力的技术保障。

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基金项目：长沙海关微创新项目，长沙市自然科学基金项目（kq2014181）

第一作者：谭建锡（1983—），男，山东潍坊人，博士，高级工程师，主要从事动物检疫工作，E-mail: 155091611@qq.com

通信作者：唐连飞（1977—），男，湖南永州人，博士，研究员，主要从事动物检疫工作，E-mail: tanglianfei@126.com

1. 长沙海关技术中心 长沙 410004

1. Technology Center of Changsha Customs, Changsha 410004

图2 实验测序序列比对结果

Fig.2 Experimental sequence alignment results of this experiment

表2 亚洲黑熊种内COⅠ序列变异位点

Table 2 Main intraspecific variation sites of Ursus thibetanus COⅠ sequence

基金项目：国家重点研发计划课题（2019YFC1904802），海关总署科研项目（2020HK256）

第一作者：廖敏萍（1994—），女，汉族，广西梧州人，硕士，助理工程师，主要从事进出口商品检验及鉴别工作，E-mail: 511616495@qq.com

通信作者：冯均利（1980—），男，汉族，江苏徐州人，硕士，高级工程师，主要从事进出口商品检验及鉴别工作，E-mail: 80205457@qq.com

1. 防城海关综合技术服务中心 防城港 538001

2. 南宁海关技术中心 南宁 530022

3. 深圳海关工业品检测技术中心 深圳 518067

1. Fangcheng Customs Integrated Technical Service Centre, Fangchenggang 538001

2. Nanning Customs Technology Centre, Nanning 530022

3. Shenzhen Customs Industry Inspection Technology Center, Shenzhen 518067