冯雨宸 兰文升 洗嘉恒 方泽坤 刘宵宵 李萍 邓伟江 余道坚

预防性消毒是一种阻截病原微生物随冷链产品外包装传播的有效手段，目前主要采用化学（含氯、过氧化物类和季铵盐类消毒剂）消毒技术，但在现场操作、环境安全和通关流通效率等方面有很大影响，同时，化学消毒存在低温效果差、易污染等不足，因此，冷链产品外包装的新型消毒技术需求十分迫切。电子束辐照（Electron Bean Irradiation，EBI）是一种使用清洁能源的先进消毒技术。EBI是一种低成本、环境友好和高效快捷杀灭微生物的手段，至今已被全球多个国家批准，作为食品化学熏蒸消毒的替代方法使用。电子束辐照可以通过直接或间接破坏微生物的生理代谢和化学反应来抑制微生物生长，甚至死亡。在辐照过程中，电子束在微生物体内产生能量转移，导致化学和分子键的破坏（如DNA结构断裂，酶和膜蛋白变性），对细菌DNA和RNA的破坏直接导致微生物死亡或导致无法繁殖，在处理农产品或食品时使用低剂量的电离辐射，可以消除微生物的污染，还能抑制果蔬发芽，延长货架期。

食品辐照加工已是国际上成熟的产业，辐照剂量一般低于10 kGy。FAO/WHO/IAEA于1980年发布联合公告，规定10 kGy以下的辐照剂量对于食品是安全无害的，低于10 kGy不需要进行食品毒理学实验来验证其安全性。我国同位素和辐射行业协会推荐外包装表面和一定穿透厚度的病毒灭活最低有效剂量为3 kGy，外包装表面病毒最高耐受剂量推荐为10 kGy，Adu-Gyamfi等使用3 kGy的电子束辐照剂量，以达到对大肠杆菌9个或以上的对数的杀灭率，Munir和Federighi推荐在不同介质和温度下，金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌的芽孢的D₁₀值分别为0.39～0.58 kGy和2.0～3.2 kGy。

本文针对冷链产品外包装可能携带病原微生物开展预防性消毒，利用低能电子束灭活装置，模拟进口冻肉外包装电子束消毒场景，参照我国相关标准开展微生物消毒效果测试，验证电子束对冷链产品外包装表面病原微生物的消毒效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

大肠杆菌（Escherichia coli，8099）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）购自上海安谱实验科技股份有限公司；枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis var. niger，ATCC 9372）购自深圳市天成亨科技有限公司。

1.1.2 培养基及试剂耗品

营养肉汤液体培养基、营养琼脂培养基、TSA固体平板、蛋白胨生理盐水溶液等购自深圳浩克生物技术有限公司；培养皿（Φ 9 cm，南通苏品实验器材有限公司）、灭菌镊子、灭菌大头针和灭菌离心管（15 mL，10 mL，广州浩特生物过滤股份有限公司）等。

1.1.3 菌片介质

滤纸（双圈牌，定性滤纸中速102，杭州新华纸业）。

1.1.4 仪器

CPD 20 电子束灭活装置（150 KeV，10 mA，中广核）；可见光分光光度计（722型，上海佑科）；培养箱（BD240，德国BINDER）；生物安全柜（NU-425-400E，美国NUAIRE）。

1.1.5 电子束辐照剂量计

GEX B3001薄膜剂量片（美国GEX）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备

从大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌黑色变种平板挑取单克隆菌，接种3 mL营养肉汤培养基37℃扩增24 h，取200 μL大肠杆菌培养物涂布TSA固体平板，37℃培养24 h，平板洗脱菌落用作调节后续培养菌悬液的浓度，其余转移至300 mL营养肉汤培养基后，在37℃下扩大培养24 h，放置4℃冰箱保存。根据前一天测试培养液中微生物菌量（菌落计数方法），制作菌片当天用营养肉汤或者平板洗脱培养菌悬液调节，至菌液工作浓度约为1×10⁸ CFU/mL。

1.2.2 测试菌片制备

吸取50 μL菌液，分别滴加到滤纸片上（1 cm×1 cm），纸片放入37℃恒温培养箱干燥，收集待用。

1.2.3 测试菌片质量评估

随机选取菌液制作的滤纸菌片进行菌落数计数，依据GB/T 38502—2020 ，每个菌片(载体)的回收菌量应为1×10⁶～5×10⁶ CFU/片，用Microsoft excel统计评估菌片的均一性。

1.2.4 电子束消毒效果测试

将待测试菌片用无菌镊子和灭菌大头针固定于冷链产品外包装纸箱（50 cm×34 cm×12 cm）6个面，包装内放置-20℃冷藏柜下预处理的冻品（-20℃下平衡2 d），以模拟冷链现场消毒场景。不同面定义为图1中的A、B、C、D、E、F面，每个面按照对角线设置3个样品位点作为不同区域的重复测试，如A1、A2、A3等，测试时，每个位点分别放置1个菌片和1个剂量片，并在菌片下同样放置1个剂量片（图1）。为保护菌片并防止菌片脱落及其传送带污染问题，在B面以食品级保鲜薄膜覆盖。3种微生物分别使用新的包装箱各重复测试3次。

1.2.5 电子束设备参数设定

根据3种指示微生物的D₁₀值和国内外相关研究^5-16]，本研究模拟进口冷链产品外包装电子束消毒的工艺剂量设定不小于5 kGy，按此剂量校设电子束消毒装置参数。外包装共有6个面，每个面分别用一台加速器进行消毒，因包装为立方体结构，与加速器电子束发生源距离不同，因此，各加速器运行参数不同。本次测试装置设备参数设定为电压140 KeV，电流分别为3 mA（C、D、F面）、5 mA（E面）和10 mA（A、B面）（图1），电子束传输带速度为20 m/min。每次仅对一冻品箱进行辐照处理，每一冻品放置18枚菌片，分别放置于冻品箱的6个面。

1.2.6 测试菌片采集

将电子束辐照后的3种不同微生物的滤纸菌片按编号收取，每一个测试菌片单独放置于15 mL灭菌试管中，同时将未经电子束辐照消毒的对照组菌片以相同方式带回。

1.2.7 剂量监测与测定

3种菌株菌片电子束辐照消毒的同时，在每一菌片固定区域附近和菌片下方各设置一个剂量薄膜监测片（型号：GEX B3001）。经电子束辐照处理后，与测试菌片同步回收剂量片，立即用可见分光光度计检测荧光吸收值，根据剂量对照表换算成辐照剂量。

1.2.8 回收菌落计数

将电子束消毒后的菌片进行实验室微生物培养和菌落计数。每个试管加入5 mL蛋白胨生理盐水溶液，充分振荡试管，使菌片携带的菌落洗脱到稀释液中。每个测试样品管中的菌液继续用蛋白胨生理盐水溶液进行10倍梯度稀释（取母液300 μL加入2.7 mL稀释液）。分别吸取制备好的稀释样品1 mL，加入空白培养皿（Φ 9 cm），设两个重复，将40～50℃熔化的适量TSA培养基倒入含菌液的培养皿中，充分混匀，待培养基凝固后，倒置在37℃培养箱，培养48 h。对照组菌片按照相同方法进行计数。

1.3 数据分析

大肠杆菌等3种细菌的杀灭率按如下公式计算

上式中，X为杀灭率（%），A为消毒前菌量或初始对照组菌量（CFU/片），B为消毒后菌量或对照组回收菌量（CFU/片）。

2 结果与分析

2.1 初始和对照菌片菌落计数

随机选取3种微生物菌液制备的滤纸菌片各10个进行微生物培养和菌落计数，初始菌片回收菌量约为2.0×10⁶～4.9×10⁶ CFU/片（表1），符合 WS/T 774—2021的要求。与电子束消毒同步实验的对照组菌片回收菌量约为2.7×10⁶～3.8×10⁶ CFU/片，与初始菌片无显著差异。

表1 3种微生物滤纸菌片初始和对照菌落计数结果

Table 1 The average colony count of three microbial carrier papers in initial group and control group

2.2 电子束消毒菌片菌落计数

模拟冻肉外包装6面消毒，利用低能电子束灭活装置对大肠杆菌、金黄色葡萄球和枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢滤纸菌片进行辐照处理，实验室微生物培养菌落总数计数结果如表2所示。

本研究设定电子束消毒工艺剂量为5 kGy，通过测定菌片下的剂量片发现，菌片平均吸剂差异较大，最低不到2 kGy，最高为14.8 kGy（表2），纸箱上部的A面和下部B面的吸收剂量明显低于其他4个面，且B面均小于设定的工艺剂量，因B面直接与束下传输带接触，菌片用一层保鲜膜覆盖，见图1。这说明低能电子束穿透能力弱（B面）或在空气中发生衰减（A面）。利用低能电子束对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌黑色变种等3种指示微生物， 162枚滤纸菌片进行辐照处理，共计6个菌片样品（杀灭率为99.34%～99.80%）以及B面金黄色葡萄球菌平均杀灭率未达到99.9%（表2），这与B面菌片表面覆盖一层0.1 mm保鲜薄膜有关。结果表明，3种指示微生物的平均杀灭率≥99.9%，杀灭率≥99.9%的菌片数为99.3%，高于我国有关消毒标准。

3 结论

本研究模拟冷链场景对产品外包装进行电子束辐照消毒，利用低能电子帘装置，设定电压140 KeV、电流3～10 mA、传输速度20 m/min和不低于5 kGy工艺剂量下，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌黑色变种等3种指示微生物滤纸菌片进行消毒，3种指示微生物的平均杀灭率≥99.9%，且杀灭率≥99.9%的样本数为99.3%，符合我国相关消毒标准。

从整体的消毒效果来看，CPD 20 电子束灭活装置可用于冷链中纸箱表面微生物消毒，但低能电子束穿透能力弱，低温环境下电子束剂量监测方法不成熟，剂量稳定性和均匀性较差，如C面金黄色葡萄球菌菌片的平均吸收剂量高达14.7 kGy，但仍有微生物残留。根据本研究结果，笔者认为虽然低能电子束消毒设备和工艺还有待于优化，但此装置与技术已初步具备在进口冷链场景下对冻品外包装进行预防性消毒的能力。

本研究验证了CPD 20电子束灭活装置对微生物具有良好的杀灭效果，可应用于冷链产品外包装表面病原微生物的预防性消毒，为筑牢国门生物安全屏障提供保障。

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a: 冻品外包装6面定义; b: 菌片和剂量片放置位置; c: 菌片下叠加剂量片

图1 冷链产品外包装6面和菌片放置位置示意图

Fig.1 The diagram of six surfaces of the outer packaging of cold chain products and sites of carrier papers

a

b

c

表2 3种微生物滤纸菌片在冷链产品外包装电子束消毒结果

Table 2 Results of electron beam disinfection of three microbial carrier papers on the outer packaging of cold chain products

基金项目：拱北海关科研项目（2021GK005）

第一作者：闫邦奇（1991—），男，汉族，山东阳谷人，本科，工程师，主要从事分子生物学研究，E-mail: yanbangqi666@163.com

通信作者：徐淼锋（1980—），男，汉族，广东梅州人，硕士，高级农艺师，主要从事植物检疫研究，E-mail: xumiaopheng@sohu.com

1. 拱北海关技术中心 珠海 519001

2. 珠海临湾堂科技有限公司 珠海 519001

1. Technical Center of Gongbei Customs District, Zhuhai 519001

2. Zhuhai Linwantang Technology Co., LTD., Zhuhai 519001