闫邦奇 徐淼锋 王祥红 水克娟 林伟 张卫东 廖力

中药降香为豆科植物降香檀树干和根的干燥心材，具有化瘀止血、理气止痛等功效^[1]，主要分布于海南省，在广东、福建、广西等地也有栽培种植。药理研究表明，降香具有舒张血管、抗炎抑菌、抗氧化、抗肿瘤等作用，尤其在心脑血管疾病治疗方面表现出较为明显的疗效^[2-5]，具有极高的药用价值。除药用价值外，由于降香檀心材质地密实，纹理美观且香气持久，是制作高档家具的优良材料，被称为“红木之首”。但因其生长缓慢，成材木料十分稀少，一件成品家具动辄百万元，是名副其实的“木中黄金”^[6]。随着木材市场的火爆，降香檀的市场需求激增，过度采伐对生态环境造成了极大破坏，现如今，降香檀已是《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅱ、《国家重点保护野生植物名录》和《中国生物多样性红色名录——高等植物卷》中的受保护物种。

由于降香资源相对短缺，在巨大利润的驱使下，药材市场混伪品不断出现，如滇黔黄檀（D. yunnanensis）、印度黄檀（D. sissoo）、交趾黄檀（D. cochinchinensis）、斜叶黄檀（D. pinnata）、两粤黄檀（D. benthami）、海南黄檀（D. hainanensis）、阔叶黄檀（D. latifolia）等经常与降香混用^[7]。因中草药在临床应用上的复杂性，中草药基原混淆、仿冒品和替代品日益增多，掺杂造假等情况容易导致患者使用后出现严重的不良反应，甚至危害到患者的生命安全^[8]。目前降香的鉴别方式多为性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等，如形态鉴别法^[9]、试管加热法^[10]、火试法^[11]、气相色谱法^[12]、液相色谱法^[13]、气相色谱-质谱联用法^[14]。虽然物理鉴别方法操作简单，但对同属近似种类却难以准确鉴别，而理化鉴别方法又操作复杂，成本高且耗时长。近年来，DNA条形码技术在物种鉴定上被广泛应用^[7,15]，例如应用DNA条形码技术对大量动植物药材进行鉴定，具有高通用性、高效筛选能力^[8,16]。然而该方法具有一定的局限性，如不同引物可能导致不同的测试结果^[17]和近缘种类难以区分等情况。

为提高降香鉴定的准确性和高效性，本研究拟对降香及其伪品，依据其基因组序列的特点，设计出适用于降香的实时荧光PCR的特异性引物和探针，建立中药降香的快速实时荧光PCR定性检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验样品

本研究选取了降香檀、滇黔黄檀、两粤黄檀、印度黄檀、斜叶黄檀、阔叶黄檀、交趾黄檀、海南黄檀8种黄檀属植物心材或叶片共15个试验样品（表1）。所有木材样品均为气干材，室内常温保存；叶片保存于-80℃超低温冰箱。

1.2 仪器与试剂

SPEX 6875冷冻研磨系统（美国SPEX sample Prep）；Eppendorf Centrifuge 5425冷冻离心机、ThermoMixer C恒温孵育器（德国艾本德公司）；ESCO class Ⅱ生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司）； FQD-96A荧光定量PCR仪（杭州博日科技股份有限公司）；DNeasy植物核酸提取Mini试剂盒（批号：169033954，德国Qiagen GmbH）；2X Superstart Premix实时荧光PCR缓冲液（批号：20220921，珠海宝锐生物科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品研磨

去除心材样品表面腐朽部分杂质，锯切成小块放入冷冻研磨系统的研磨罐中，在液氮条件下，将这些样品研磨成细木粉，分装至2 mL的离心管中，置于-80℃低温冰箱中保存备用。

1.3.2 DNA提取

所有的DNA提取操作必须在洁净环境中进行，以避免外源污染。本研究采用改进的DNeasy植物核酸提取Mini试剂盒方法^[18]，基于原有试剂盒方法进行了改进，在裂解时加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蛋白酶K、RNaseA。

1.3.3 引物探针设计

本研究通过NCBI数据库检索黄檀属种类的叶绿体全基因组序列和样品测得的序列，利用MEGA 7.0进行比对分析，采用Primer 5.0软件和NCBI中Primer-Blast在黄檀属叶绿体基因组cemA与petA基因之间的非编码片段，筛选设计了特异性引物探针Do4和黄檀属通用引物探针petA（表2），引物探针由广州天一辉远基因科技有限公司合成。

1.3.4 实时荧光PCR反应

实时荧光PCR反应体系的反应总体积为25 μL。各组分组成如下：12.5 μL 2×PCR缓冲液（2X Superstart Premix，含dNTP混合液，Mg²⁺），DNA模板5 μL，上下游引物（10 μM）0.75 μL，探针（10 μM）0.5 μL，加入ddH₂O补足体积至25 μL，体系配好后进行实时荧光定量PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火、延伸60 s，40个循环。

1.3.5 通用性和DNA提取有效性验证

以黄檀属8个近似种的15个试验样品所提取的基因组DNA为模板，采用1.3.4节所述实时荧光PCR反应体系及条件，对黄檀属通用引物探针petA进行通用性验证，同时对利用1.3.2节所述DNA提取方法提取的基因组DNA进行验证，根据结果判断是否提取到有效基因组DNA。

1.3.6 特异性检测

利用降香檀、滇黔黄檀、两粤黄檀、印度黄檀、斜叶黄檀、阔叶黄檀、交趾黄檀、海南黄檀8种黄檀属植物心材或叶片共15个试验样品所提取的基因组DNA，采用1.3.4节所述实时荧光PCR反应对本研究中设计的Do4引物探针进行特异性验证。

1.3.7 灵敏度验证

将提取的降香檀DNA分别进行梯度稀释至100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL，以梯度稀释的DNA为模板进行实时荧光PCR反应，每个梯度进行了3次重复实验，检测特异性引物探针的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 通用性和DNA提取有效性验证

以黄檀属8个近似种15个试验样品所提取的基因组DNA为模板，用所建立的实时荧光定量PCR检测体系，对黄檀属通用引物探针petA进行通用性验证，同时对提取的基因组DNA有效性进行验证。结果显示，15个试验样品均能扩增荧光曲线（图1），且Ct值均小于20，表明petA引物探针对黄檀属具有良好的通用性，采用的DNA提取方法能够从木材中提取到有效基因组DNA。

2.2 特异性检测

用所建立的实时荧光定量PCR检测体系，对降香檀、滇黔黄檀、两粤黄檀、印度黄檀、斜叶黄檀、阔叶黄檀、交趾黄檀、海南黄檀8个近似种15个试验样品进行特异性检测。结果显示，仅降香檀样品能扩增出荧光曲线（图2），其他近似种类均未扩增出荧光曲线，表明Do4引物探针具有良好的特异性。

图1 黄檀属通用性引物探针（petA）实时荧光PCR扩增图谱

Fig.1 The amplification map of universal primers and probes (petA) for Dalbergia spp.

1～3: 降香檀(Do191201、Dod-2、Dod-3); 4～15: 印度黄檀、两粤黄檀、斜叶黄檀、滇黔黄檀、阔叶黄檀、交趾黄檀、海南黄檀

图2 中药降香特异性扩增图谱

Fig.2 The specific amplification map of Dalbergia odorifera

2.3 灵敏度验证

用特异性引物探针Do4所建立的实时荧光定量PCR检测体系，以提取的降香檀DNA稀释7个10倍浓度梯度（100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL）的DNA模板来确定PCR反应的检测灵敏度，每个梯度重复3次。结果显示（图3），模板浓度在0.001～100 ng/μL时均能扩增出荧光曲线；当DNA模板浓度为0.0001 ng/μL时，未能扩增出荧光曲线，表明该方法的检测限度为0.001 ng/μL，最适检测浓度为0.01～100 ng/μL。

1: 100 ng/μL; 2: 10 ng/μL; 3: 1.0 ng/μl; 4: 0.1 ng/μL; 5: 0.01 ng/μl; 6: 0.001 ng/μL

图3 中药降香灵敏度扩增图谱

Fig.3 The sensitivity amplification map of Dalbergia odorifera

3 结论与讨论

DNA提取是实时荧光PCR鉴定的首要环节，能否获得符合要求的DNA是本研究的关键之一。降香药材为降香檀的树干和根的干燥心材，质地坚硬，大部分中药材尤其是加工产品受高温、存储时间等因素的影响，木材组织的DNA普遍发生严重降解，导致DNA含量显著减少^[18]。本文采用液氮研磨的方法将样品在超低温条件下充分研磨成粉末，利用改进的DNeasy植物核酸提取Mini试剂盒方法，从降香木材中提取符合要求的DNA片段，为降香实时荧光PCR检测方法的建立提供了基础，同时也为其他木材及其制品的DNA提取提供了技术参考。

植物性中药材的分子生物学鉴别多采用核基因序列ITS2片段，物种水平的鉴定效率高达92.7%，获得国际DNA条形码领域的广泛认可^[16]。余敏等^[19]对ITS2序列进行扩增，通过聚类分析可以区分降香檀和多裂黄檀。侯典云等^[7]利用通用引物测定ITS2片段序列，通过中药材DNA条形码鉴定系统和构建邻接树法对降香药材及其混伪品进行鉴定。李奇威等^[20]通过测定分析了ITS2序列变异位点，对降香檀、越南黄檀和多裂黄檀进行了有效区分。由于黄檀属种类ITS2变异位点少，无法在这个片段上设计有效的引物探针对降香檀进行鉴别，因此，本研究针对降香檀叶绿体非编码基因设计了特异性引物探针，通过特异性检测显示引物探针Do4的特异性良好，仅降香檀样品能扩增出荧光曲线，其他近似种类均未扩增出荧光曲线，并且该引物探针灵敏度高，检测限度为0.001 ng/μL，最适检测浓度为0.01～100 ng/μL，完全可以解决降香药材DNA降解严重和DNA含量少的问题。

综上所述，本研究建立的针对中药降香的快速实时荧光PCR定性检测方法，具有特异性强、灵敏度高、检测周期短的优势，可用于降香药材及其产品的快速鉴定和分析，有效提高中药降香真伪鉴别水平。然而，针对目前中药材市场降香掺伪严重，甚至按定价来定制掺伪比例的情况，该方法无法对降香药材是否掺伪及掺伪比例进行定量鉴定。近年来，采用数字PCR技术可成功进行樱桃果汁掺伪检测^[21]、羊肉成分掺假鉴定^[22]，因此，后续将开展中药降香掺伪定量检测技术研究，可为相关监管部门、行业协会、企业提供科学的技术支撑，进一步规范降香的药材市场贸易。

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表1 试验样品信息

Table 1 Test samples list

表2 引物探针信息

Table 2 The sequences of primers and probes

注: *代表探针中添加Tm增强剂(LNA)可提高探针退火温度

基金项目：汕头海关科研项目（2022STK003）

第一作者：魏建华（1977—），女，汉族，山西大同人，硕士，高级工程师，主要从事理化检测工作，E-mail: huajianwei@126.com

1. 汕头海关 汕头 515031

2. 广州海关 广州 510623

3. 宁波海关 宁波 315000

1. Shantou Customs, Shantou 515031

2. Guangzhou Customs, Guangzhou 510623

3. Ningbo Customs, Ningbo 315000