魏建华 吴剑光 魏霜 方毅 张吉红 刘立勋

受传统观念和消费习惯的影响，我国一直以来就是红木的主要消费大国，而绝大多数红木树种都产于国外，所以红木成为我国进口的国际大宗贸易商品^[1]。濒危木材是红木中常见的黄檀属，比如降香黄檀、阔叶黄檀、卢氏黑黄檀、东非黑黄檀、伯利兹黄檀、巴里黄檀、赛州黄檀、交趾黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CTIES）附录Ⅰ和Ⅱ。木材物种鉴定专业性强、技术要求高，濒危木材与其相似物种，需要相关数据库、快速鉴别方法和自动化信息化等方面的技术创新，这样濒危木材进口监管和执法才能获得有力的技术支持^[2]。

濒危木材往往具体到“种”，即木材分类的基本单元，而传统木材识别常常只能精确识别到“属”，即位于分类单位“种”之上，因此传统木材识别在满足《濒危野生动植物种国际贸易公约》履约执法和国内市场监管需求方面有局限性。实践中会出现某些同属但是种间鉴定有争议的情况，或者由于物种多样性和变异等因素，导致形态特征会有差异，从而使得形态学上鉴定特异性不强，因此采用多种理化检测手段可以作为形态学辅助手段扩展鉴定范围和准确性，有利于更精确地鉴定种间濒危木材^[3]。

近年来，发展起来的树种识别技术有DNA标记法、高光谱成像技术、红外光谱技术及气相色谱技术结合指纹图谱技术。由于DNA的提取受到很大限制，导致DNA标记法很难应用到实际工作中。高光谱图像既包含光谱信息，又包括图像信息，数据的分析和提取比较复杂，对检测人员的要求较高。气相色谱技术由于技术所限，不能检测挥发性差、热稳定性差和离子型样品，导致鉴定方法的特异性不强^[4-8]。通过高效液相法做出的指纹图谱包含的指纹峰多，更有特异性。本研究依据同“种”木材提取物的化学成分具有相似性，不同“种”木材提取物的化学成分具有差异性，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）技术获取木材的提取物中的化学成分信息，并利用计算机指纹图谱技术选择同一树种色谱谱图中稳定出现的特征峰构建该树种的标准指纹图谱，表征该树种的共同化学特征；不同树种的标准指纹图谱具有明显差异性，体现在特征峰的数目不同、特征峰的保留时间不同，这些差异反映的是树种间化学成分以及其含量的不同，作为树种间鉴别的依据。本研究尝试作为传统基于形态学木材识别的辅助和补充，以期应用于口岸的濒危木种的快速识别。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

选用Agilent 1200型HPLC：二极管阵列检测器，四元梯度泵；密理薄超纯水仪；梅特勒-托利多AL204-IC电子分析天平（瑞士）； C9860A型超声波清洗器。液相用乙腈为色谱纯；液相用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 实验材料

红木样品：降香黄檀、阔叶黄檀、卢氏黑黄檀、东非黑黄檀、伯利兹黄檀、巴里黄檀、赛州黄檀、交趾黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀共10个种的红木，合计121个样品。具体样品信息见表1。本实验材料部分来自于汕头海关，部分购买于木材加工企业，所有样品都通过本单位从事木材鉴定人员的鉴定，明确木种名称。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相：水和乙腈，梯度洗脱程序见表2；波长：290 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min。

表2 梯度洗脱程序

Table 2 Gradient elution procedure

1.4 制备供试品

称取样品：芯材部分木屑0.200 g(精确至0.001 g)，置于离心管中，然后加入5 mL甲醇、5 mL高纯水，振摇5 min。提取方式为：超声波5 min，使用滤纸过滤，再取少量滤液经0.2 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液^[]。

1.5 检测

吸取供试品溶液，使用HPLC检测，进样量为20 μL。

1.6 数据分析

将经过HPLC采集的木材图谱，使用相似度评价软件分析，包括指纹图谱共有峰、强峰、特征峰确证和相似度分析，为同种的多个样品设定对照图谱，并建立相应的谱库。

将每个收集到的树种的HPLC采集谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，具体步骤为：以0.1～0.2 min作为选取的时间窗宽度，生成对照谱图方式是中位数，多点校正之后进行自动匹配，得到指纹图谱对照谱图，分别将所比对批次样品的指纹图谱与该对照谱图的相似度计算出来，再从多批木材的共有峰中筛选出峰面积比较大、稳定出现的峰作为标准指纹图谱中的特征峰，从而建立标准指纹图谱。

2 结果与分析

本研究通过收集正确定名的濒危木材样品，建立适合的高效液相前处理以及色谱方法， 运用相似度分析软件进行指纹图谱分析，考察所得到的同一树种的共有峰，确定共有特征峰，建立相应树种的标准指纹图谱；共研究了10种常见黄檀属濒危木材树种，其中降香黄檀又包括油梨和糠梨，建立了11个红木标准HPLC色谱指纹图谱；从初步得到的指纹图谱的共有峰中筛选稳定出现的、峰面积比较大的特征峰，构成常见的黄檀属HPLC标准指纹图谱，共有特征峰中面积最大的峰就是强峰；分别建立了降香黄檀、阔叶黄檀、卢氏黑黄檀、东非黑黄檀、伯利兹黄檀、巴里黄檀、赛州黄檀、交趾黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀，其中降香黄檀又包括油梨和糠梨，共11个HPLC标准指纹图谱，每个标准指纹图谱基于相互独立的4～18个正确定名的常见黄檀属濒危木材样品的指纹图谱，其对应的标准指纹图谱如图1所示。

3 讨论

本研究将疑似濒危木材样品的HPLC指纹图谱与建立的常见黄檀属濒危木材HPLC标准指纹图谱对比，根据相似度以及共有特征峰相对保留时间进行鉴别。作为指纹图谱研究的重要参数色谱条件中波长的选择，我们主要考虑以下两方面：能较多地检测出木材浸提物中的化学物质，以便于呈现其整体特征，但又不能太多，否则色谱峰数量太多，会使后续统计分析工作量太大；同时对于常见黄檀属濒危木材，其目的在于与其他木材以及近似种的区分，需要采用相同波长，该波长能兼顾多个树种或者掺伪树种指纹图谱的研究，以便比较。沈明月等^[9]采用波长为290 nm研究了4种红木的HPLC指纹图谱。本研究参照文献，采用同样的波长^[10-11]。从实验结果来看，采用该波长能够满足特定与其他木材以及近似种的区分。

本研究共收集到10个树种的常见黄檀属濒危木材，其中降香黄檀又分为油梨和糠梨两个类别，每树种4～18个样品，这些样品都经过木材鉴定人员正确定名；建立样品预处理方法以及HPLC指纹图谱液相方法；应用色谱指纹图谱相似度评价软件，确定建立标准谱库的样品，找出共有特征峰，筛选出稳定出现的标准谱图的特征峰，建立确定色谱条件下的液相化学指纹图谱谱库，探索常见黄檀属濒危木材“种”水平的快速识别新途径，以期为濒危木材进口监管和执法提供技术支撑。

参考文献

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[2]何拓, 刘守佳, 尹江苹, 等. CITES濒危木材管理政策及我国履约对策研究[J]. 木材科学与技术, 2022, 36(4): 77-80+87.

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[11]中山市中广测协同创新中心. 基于指纹图谱的微损鉴别刺猬紫檀种属的方法[P]. 中国: 105588908 A, 2016-05-18.

表1 样品信息

Table 1 Sample information

注: “—”表示样品购自木材市场且来源国信息不详

表1（续）

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20

0

信号 (mV)

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S2

S1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

时间 (min)

S1为降香黄檀(油梨); S2为降香黄檀(糠梨); S3为东非黑黄檀; S4为卢氏黑黄檀; S5为伯利兹黄檀; S6为微凹黄檀; S7为赛州黄檀; S8为阔叶黄檀; S9为交趾黄檀; S10为巴里黄檀; S11为奥氏黄檀标准指纹图谱。

图1 标准指纹图谱

Fig.1 Standard fingerprint