申子晋 方振刚 王志昱 赵发宝

2017—2022年山东地区归国人员 疟疾感染情况调查及风险因素分析

…………………………………………………………………… 马 赛 胡 薇 冯茹荔 王 苑 卜宏磊 杜 辉 梁 萌

20 一步法实时荧光RT-PCR 在疟原虫检测中的应用

………………………………………………………… 何丽润 曾华颖 郑 夔 戴 俊 师永霞 孙芳芳 杨可航 蔡扬尧

◎ 商品检验

25 ICP-OES测定铜精矿中砷含量的 不确定度评定

………………………………………………………… 许一鸣 刘珊珊 张 斐 戴金兰 梁 震 涂满娣 林天日 周 磊

31 高温燃烧水解-自动电位滴定法 测定进口煤中氯含量的方法研究

…………………………………………………………………………………………………… 申子晋 方振刚 王志昱 赵发宝

37 不同层数下织物紫外性能变化研究

…………………………………………………………………………………………………… 朱 成 董 涵 周 叶 杨荣静

◎ 食品安全

44 小杂粮中重金属元素调查研究及健康 风险评估

…………………………………………………………………………………………………… 张鑫鑫 杨燕强 花 锦 武 曦

50 实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼 成分方法的建立及初步应用

………………………………………………………… 刘立兵 周 藏 付 琦 孙晓霞 王金凤 钱云开 艾连峰 王建昌

59 气相色谱-三重四极杆质谱法测定玉米 及其种植土壤中16种多环芳烃方法研究

………………………………………………………… 李 志 张馨允 赵 阳 王兴宁 付海滨 于 丽 栗 杰 张 敏

66 HPLC-MS/MS法测定热带水果中 新烟碱类杀虫剂哌虫啶和环氧虫啶

…………………………………………………………………………………………………… 庄 鹏 纪少凡 谢宏洋 李 备

74 LA-ICP-MS同时测定奶粉中 铅、镉、铜、铁元素含量

……………………………………………………………………………………………………………… 苑 利 张敏爱 姚亚婷

80 胶体金免疫层析法检测食品中 四氢大麻酚成分研究

………………………………………………………… 涂晓波 王子琳 张佳瑜 黄欣迪 牛 娜 张建莹 张 恒 吕敬章

88 动物源性食品中多种兽药残留 UPLC-MS/MS分析方法的构建

…………………………………………………………………… 解迎双 张 欢 王新潮 白兴斌 刘兰霞 寇宗红 王溪桥

CONTENTS

CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY

◎ Feature • Prevention and Control of Malaria (I)

04 Application of Four Methods in the Diagnosis of a Suspected Malaria Case at the Port

…………………………………………………………………………… MA Qian-Li HU Shuang-Shuang LIU Cai-Wan SHI Quan

……………………………………………………………………… YANG Guo-Ping SU Xiao-Jian HU Xue-Feng YANG Qing-Gui

09 Discussion of Imported Malaria Situation and Prevention and Control Strategies at Changzhou Port

………………………………… FENG Mi-Jia QIU Wen-Yi XU Yan-Fei LI Cui-Xia ZHENG Na HU Xue-Feng YANG Qing-Gui

14 A Survey of Malaria Infection among Returnees in Shandong Area during 2017 - 2021 and Analysis of Risk Factors

………………………………………………… MA Sai HU Wei FENG Ru-li WANG Yuan BU Hong-lei DU Hui LIANG Meng

20 Application of One-Step qRT-PCR in the Detection of Plasmodium

…………… HE Li-Run ZENG Hua-Ying ZHENG Kui DAI Jun SHI Yong-Xia SUN Fang-Fang YANG Ke-Hang CAI Yang-Yao

◎ Commodity Inspection

25 Uncertainty Evaluation of Determination of Arsenic in Copper Concentrate by Inductively Coupled Plasma Emission Spectroscopy

……………………… XU Yi-Ming LIU Shan-Shan ZHANG Fei DAI Jin-Lan LIANG Zhen TU Man-Di LIN Tian-Ri ZHOU Lei

31 Research on Determination of Chlorine Content in Imported Coal by High Temperature Combustion Hydrolysis-Automatic Potentiometric Titration

……………………………………………………………………… SHEN Zi-Jin FANG Zhen-Gang WANG Zhi-Yu ZHAO Fa-Bao

37 A Study on UV Performance Change of Fabrics with Different Layers

………………………………………………………………………………… ZHU Cheng DONG Han ZHOU Ye YANG Rong-Jing

◎ Food Safety

44 Investigation and Health Risk Assessment of Heavy Metal Elements in Small Coarse Cereals

………………………………………………………………………………… ZHANG Xin-Xin YANG Yan-Qiang HUA Jin WU Xi

50 Establishment and Preliminary Application of Real-time PCR for Detecting Four Common Histamine-rich Fish Ingredient

…………… LIU Li -Bing ZHOU Cang FU Qi SUN Xiao-Xia WANG Jin-Feng QIAN Yun-Kai AI Lian-Feng WANG Jian-Chang

59 Determination of 16 PAHs in Corn and Its Planting Soil by Gas Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry

……………………………… LI Zhi ZHANG Xin-Yun ZHAO Yang WANG Xing-Ning FU Hai-Bin YU Li LI Jie ZHANG Min

66 Determination of Neonicotinoid Insecticides Paichongding and Cycloxaprid in Tropical Fruits by HPLC-MS/MS

………………………………………………………………………………… Z HUANG Peng JI Shao-Fan XIE Hong-Yang LI Bei

74 Determination of Lead, Cadmium, Copper and Iron in Milk Powder by LA-ICP-MS

……………………………………………………………………………………………… YUAN Li ZHANG Min-Ai YAO Ya-Ting

80 Determination of Tetrahydrocannabinol in Food by Colloidal Gold Immunochromatographic Assay

………………………………………………………………………… T U Xiao-Bo WANG Zi-Lin ZHANG Jia-Yu HUANG Xin-Di

………………………………………………………………………… NIU Na ZHANG Jian-Ying ZHANG Heng LYU Jing-Zhang

88 Development of a UPLC-MS/MS Analysis Method for Multiple Veterinary Drug Residues in Animal-Derived Foods

…………… XIE Ying-Shuang ZHANG Huan WANG Xin-Chao BAI Xing-Bin LIU Lan-Xia KOU Zong-Hong WANG Xi-Qiao

CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY

基金项目：南京海关科研项目（2021KJ25）

第一作者：马千里（1995—），男，汉族，江苏沭阳人，本科，检验技师，主要从事卫生检验工作，E-mail: mqlma@outlook.com

通信作者：杨庆贵（1977—），男，汉族，安徽肥东人，博士，主任技师，主要从事病原生物学研究，E-mail: yqg1995@126.com

1. 江苏国际旅行卫生保健中心（南京海关口岸门诊部） 南京 210019

2. 南京禄口机场海关 南京 211113

3. 安徽国际旅行卫生保健中心（合肥海关口岸门诊部） 合肥 230061

1. Jiangsu International Travel Healthcare Center (Nanjing Customs Port Clinic), Nanjing 210019

2. Nanjing Lukou Airport Customs, Nanjing 211113

3. Anhui International Travel Healthcare Center (Hefei Customs Port Clinic), Hefei 230061

中国口岸科学技术

Abstract A suspected case of malaria imported at the Nanjing port was diagnosed by four detection methods, including thick and thin blood smear microscopy, RDT malaria antigen detection, real-time fluorescent quantitative PCR and micro-drop digital PCR, and the application scenarios of different detection methods were compared and analyzed to provide technical support for the prevention and control of infectious diseases at the port. Plasmodium falciparum was positive in the four detection methods, and the original concentration of nucleic acid was 157 copies/μL in the micro-drop digital PCR detection. The results showed that the RDT antigen detection was the most rapid and simple with the lowest comprehensive cost among the four detection methods. With a clear epidemiological history and clinical manifestations of the case, RDT malaria antigen detection can be conducted first, and the other three methods can be used as auxiliary detection methods.

Keywords port; malaria; microscopy of Plasmodium; droplet digital PCR; real-time fluorescence quantitative PCR; RDT Plasmodium antigen detection

疟疾是一种以蚊虫叮咬为主要传播方式的虫媒传染病，病原体为疟原虫。疟原虫（ Plasmodium）是一类单细胞、寄生性的原生动物类群，属原生动物门顶复亚门（Apicomplexa）孢子纲（Sporozoea）球虫亚纲（Coccidia）真球虫目（Eucoccidiida）血孢子亚目疟原虫科^[1]。恶性疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫4种疟原虫是致人类疟疾的主要病原体，其中死亡率最高的是恶性疟^[2]。直至今天，疟疾防控形势依然严峻，在非洲等落后地区疟疾依然是威胁生命的一大公共卫生风险。2021年全球估计有2.47亿疟疾病例，疟疾死亡人数估计为61.9万人^[3]。我国在2021年6月30日已通过世卫组织无疟疾认证^[4]，但是每年依然有数千例输入性病例。因此，建立快速准确的疟原虫检测方法对于口岸疟疾的防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

用EDTA-K₂抗凝管采集入境发热病人全血。存储于实验室4℃样本冰箱中。

1.1.2 仪器

Quantistudio 5荧光定量PCR仪（ABI公司）；QX200^TM Droplet Digital^TM PCR检测系统，包括微滴生成仪和微滴读取仪（Biorad公司）；奥林巴斯CX43显微镜。

1.2.3 试剂

贝索瑞氏染色液；香柏油；胶体金法恶性疟原虫/间日疟原虫检测试剂盒（蓝十字生物药业有限公司）；凯杰血液核酸提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit (50)；ddPCR^TM Supermix for Probes（1863023，Biorad公司）；疟原虫荧光PCR核酸检测试剂盒，包括通用型和分型试剂盒（广州达安生物科技有限公司）；用于ddPCR的疟原虫引物和TaqMan荧光探针：18S rRAN-F 5'-GCTCTTTCTTGATTTCTTGGATG-3'，18S rRAN-R 5'-AGCAGGTTAAGATCTCGTTCG-3'，18S rRAN-P5'-VIC-ATGGCCGTTTTTAGTTCGTG-TAMRA-3'。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（凯杰）提取血样中DNA，存储于-20℃样本冰箱备用。

1.2.2 厚薄血膜涂片镜检

薄血膜滴加5～8滴瑞氏染液，染色1～2 min后加5～8滴蒸馏水。将染液和蒸馏水混匀后引到厚血膜上，染色10 min。用清水冲去染液，晾干。

1.2.3 RDT疟原虫抗原检测

在试剂卡样品孔加入5 μL全血，随后加入3～4滴稀释液，15 min后观察结果。判定标准为：在质控线（C）和检测线（T1、T2）处显示红色条带即恶性/间日疟原虫抗原阳性；在质控线（C）和检测线（T1）处显示红色条带即恶性疟原虫抗原阳性；在质控线（C）和检测线（T2）处显示红色条带即间日疟原虫抗原阳性；只有质控线（C）处显示红色条带为阴性；其余结果无效。

1.2.4 实时荧光定量PCR反应体系和反应条件

实时荧光定量PCR反应体系为PCR反应液A 17 μL，PCR反应液B 3 μL，扩增体系20 μL。PCR反应条件见表1。

反应体系中加入5 μL DNA模板，以表1反应条件上机扩增。

1.2.5 ddPCR反应体系及条件

利用微滴生成器，在微滴发生卡样本孔中加入反应液和70 μL微滴发生油制备反应微滴，ddPCR反应体系见表2；在96孔PCR反应板中加入样品的微滴并进行扩增，扩增程序见表3。

表1 实时荧光定量PCR反应条件

Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction condition

表2 ddPCR反应体系

Table 2 ddPCR reaction system

表3 ddPCR扩增程序

Table 3 ddPCR amplification procedure

反应结束后，采用微滴分析仪进行分析，用Quantasoft 1.7.4 软件自动处理数据。

2 结果

2.1 疟原虫镜检结果

薄血膜涂片可见恶性疟原虫环状体（图1），初步判断为恶性疟原虫感染。

图1 疟原虫薄血膜涂片检测结果

Fig.1 Results of Plasmodium thin blood film smear

2.2 RDT抗原检测结果

依据试剂说明书判断检测结果为恶性疟原虫抗原阳性，如图2所示。

图2 疟原虫抗原检测结果

Fig.2 Results of Plasmodium antigen test

2.3 荧光定量PCR结果

依据4种疟原虫核酸扩增图谱可判断样本恶性疟原虫核酸阳性，其他3种疟原虫核酸检测阴性，PCR扩增图谱如图3～6所示。

图3 恶性疟原虫PCR扩增图谱

Fig.3 PCR amplification map of Plasmodium falciparum

2.4 ddPCR结果

ddPCR一维荧光振幅图如图7所示，根据软件分析结果计算出恶性疟原虫核酸原始浓度为157 copies/μL。

图4 间日疟原虫PCR扩增图谱

Fig.4 PCR amplification map of Plasmodium vivax

图5 三日疟原虫PCR扩增图谱

Fig.5 PCR amplification map of Plasmodium malariae

图6 卵形疟原虫PCR扩增图谱

Fig.6 PCR amplification map of Plasmodium ovale

3 讨论

口岸经常有入境旅客出现不明原因发热的情况，此时通常会优先排查流感以及一些常见虫媒传染病，例如寨卡、黄热、疟疾等，通过流行病学调查和观察临床症状可缩小排查范围，再结合实验室病原学检测可进行初步诊断。

疟疾的检测方法通常有厚薄血涂片镜检、RDT（rapid diagnostic test）疟原虫抗原检测、实时荧光定量PCR（real time qPCR）。此3种检测方法呈阳性并结合临床症状及流行病史均可确诊疟疾^[5]。其中，血涂片镜检是最为直接的手段，通过显微镜查找疟原虫不同阶段的结构来确认病例是否感染疟疾，优点是快速直接，但是对检测人员要求较高，需要丰富的经验。另外，形态学检查具有较强的主观性，容易造成误判。RDT疟原虫抗原检测是一种简便、快速的检测方法，利用免疫层析式双抗体夹心法，定性检测人全血中间日疟原虫特有的特异性乳酸脱氢酶（pLDH）、恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白（HRPII）^[6]，具有较强的特异性，对检测人员要求不高，适用于现场、疫区等条件较差的地区，成本低廉，对于疟疾疫情的全球防控具有重要意义，但是灵敏度相对较低。荧光定量PCR检测具有灵敏度高、特异性强等优点，对检测人员培训要求相对不高，但是对硬件设施要求较高，不适于偏远及欠发达地区开展大规模筛查。

微滴式数字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）的概念由Kenneth Kinzler和Bert Vogelstein于1999年首次提出^[7]，其基本原理是将样本中的待检测核酸分子分配至几万甚至几十万份的微滴中，此过程遵循泊松分布（P(X＝k）＝)，最终使核酸分子在每个微滴中独立扩增产生荧光信号，检测器收集荧光信号并统计出未扩增微滴占总微滴的比例，最后通过泊松分布公式计算出样品中待检测核酸分子的拷贝数，该方法有极低的检测下限，理论上可达到2 copies/μL。

疟疾的传统检测方式为显微镜检查，通常以厚血膜查找原虫，薄血膜鉴定虫种。镜检查见疟原虫为疟疾感染最为直接的病原学证据，因此镜检在疟疾诊断中占有重要地位。但是与其他检测手段相比，形态学检查不易标准化，不确定因素多，现阶段缺少有经验的镜检人员，这些都限制了其在诊断中的应用。RDT抗原检测灵敏度和特异性较好，具有操作简便、时效性强等优点，对于针对性鉴定恶性疟原虫具有优势，目前是疟疾的诊断标准之一，但是大部分抗原检测试剂只能同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫，在虫种鉴定方面存在一定局限性。实时荧光定量PCR相较抗原检测具有更高的灵敏度和特异性，可很好地满足疟疾的诊断需求，但是操作比较烦琐，设备和试剂成本较高。微滴数字PCR（ddPCR）是一种新技术，能够以高分析灵敏度和精密度对核酸进行绝对定量。ddPCR通过微流控芯片将PCR试剂分成数万个纳升或皮升，使每个液滴包含0或1个DNA模板。PCR扩增和荧光检测后，通过泊松统计根据正负液滴数计算目标核酸，与传统的qPCR相比，数字PCR具有更高的灵敏度、特异性和准确性，适用于样本中极微量核酸的检测。

4 结论

通过比较几种方法在实际中的应用，结合当前以输入性病例为主的疟疾防控形势，可以将RDT疟原虫抗原检测作为首选方法，并以疟原虫显微镜检查、微滴式数字PCR、实时荧光定量PCR等方法作为辅助检测方法，有利于缩短检测时间和节约检测成本。

参考文献

[1] Burton Bogitsh, Clint Carter. Thomas Oeltmann, Human Parasitology[M]. Oxford: Elsevier, 2018.

[2] Zhang Q, Lai S, Zheng C, et al. The epidemiology of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum malaria in China, 2004—2012: from intensified control to elimination[J]. Malaria Journal, 2014, 13(1): 1-9.

[3] Zhou X N. China declared malaria-free: a milestone in the world malaria eradication and Chinese public health[J]. Infectious diseases of poverty, 2021, 10(1): 98-99. 

[4] Mancusi A, Giordano A, Bosco A, et al. Development of a drop-let digital polymerase chain reaction tool for the detection of Toxoplasma gondii in meat samples[J]. Parasitology Research, 2022, 121(5): 1467-1473.

[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 疟疾的诊断: WS 259-2015[S].北京: 人民卫生出版社, 2015.

[6] Ricks K M, Adams N M, Scherr TF, et al. Direct transfer of HRPII-magnetic bead complexes to malaria rapid diagnostic tests significantly improves test sensitivity[J]. Malaria journal, 2016(15): 399.

[7] Zhang T, Niu Z, Wu F, et al. Qualitative and quantitative detection of surgical pathogenic microorganisms Escherichia coli and Staphylococcus aureus based on ddPCR system[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1): 8771. 

图7 恶性疟原虫ddPCR一维荧光振幅图

Fig.7 ddPCR one-dimensional fluorescence amplitude map of Plasmodium falciparum

疟疾作为一种可以威胁生命的寄生虫病，目前全球仍有将近一半人口面临其风险。截至2021年，世界上大约95%的疟疾病例、96%的疟疾死亡病例出现在撒哈拉以南的非洲地区^[1]。中国政府积极采取措施，在2021年6月30日通过世界卫生组织（WHO）消除疟疾认证，也是30多年来西太平洋地区第一个取得这一殊荣的国家^[2]。但是消除疟疾不等于消灭疟疾，2021年我国境外输入性疟疾病例达798例，来源于三大洲的37个国家^[3]。在“一带一路”等国际交流与合作日趋频繁的背景下，我国同样面临着疟疾输入和再传播的压力。为防止疟疾卷土重来，应始终保持警惕，持续推进境外输入性疟疾防控工作。

1 常州市疟疾疫情流行历史及现状

常州市疟疾流行历史久远。建国初期，常州地区疟疾发病水平较高，1950—1954年年均发病率为138.3例/万人^[4]，之后还暴发过两次疟疾疫情，分别发生在20世纪60年代（发病率1268.7例/万人）和70年代（发病率584.9例/万人），之后未再出现大规模流行。由于各级政府及有关部门重视，经过50余年的综合防控工作，常州市已有效控制当地疟疾疫情，并在2015年成为江苏省内首批通过市级消除疟疾达标考核的城市。

随着《中国消除疟疾行动计划（2010—2020年）》的执行，常州市疟疾防治监测网络得到进一步完善。2010—2020年，常州市报告疟疾病例233起，除了2010年本土病例2例及外省病例1例外，2011年后都是境外输入性疟疾病例^[5]。病例主要为22～59岁的男性中青年。境外输入性病例中，95.7%（220例）来自非洲国家，3.5%（8例）来自东南亚；出境事由92.61%（213例）为外出务工；1月份报告病例最多，其次为5月、8月、10月、11月，12月病例最少；病例中占比由高到低依次为恶性疟71.62%（164例），卵形疟18.34%（42例），间日疟6.99%（16例）和三日疟3.06%（7例），恶性疟在历年报告病例数的比重都是最大的。由此可见，自2011年以来，境外输入性疟疾已经成为常州市疟疾防治工作中的重点和难点，尤其是最近几年去非洲、东南亚和其他疟疾流行地区的外出务工人员渐增，加强这类群体回国后的疟疾监测工作，对预防境外疟疾输入与再传播十分必要。

2 常州口岸输入性疟疾防控策略

2.1 出境前疟疾防控知识宣传

常州国际旅行卫生保健中心（以下称“保健中心”）通过多种形式加大对出国人员疟疾防控知识的宣传力度，对到境外疟疾疫区的人员提供健康咨询服务，并免费发放防蚊药具和抗疟药品。每年4月26日是“全国疟疾日”，常州海关通过在常州奔牛国际机场、录安洲码头出入境口岸和保健中心进行疟疾宣传，并对将要离境或者有离境计划的旅客开展疟疾知识问卷调查及宣传教育。

2.2 入境时口岸传染病监测

一是在常州奔牛国际机场、录安洲码头做好医学巡查和体温监测等工作，对从疟疾流行区域归国的发热病人，或者交通工具运营者、旅客等自愿申报的案例，开展疟疾筛查。二是根据《中华人民共和国国境卫生检疫法实施细则》，保健中心对在境外居住一年以上的中国籍人员进行回国传染病监测，在此过程中发现的发热病人或由于畏寒、发热等身体不适而主动前来咨询的归国人员，保健中心提供免费的疟疾检查，并及时向常州市疾控中心提供疟疾病例信息，配合后续处置和调查。

2.3 联防联控机制的建立和完善

2.3.1 联防联控机制的建立

常州国际旅行卫生保健中心常年为常州口岸传染病监测工作提供技术支撑，在2014年连续监测到2例归国劳务人员输入性疟疾疫情后，建立和完善了联防联控机制。一是与常州市疾病预防控制中心血防所进行了交流合作。疾控中心开放保健中心传染病网络直报系统相关权限，使之成为法定传染病上报单位。双方建立输入性疟疾联防联控合作备忘录，并且制定了涵盖疟疾知识宣传、技术人员培训、疫情监测上报、病例接转诊、病例信息共享等内容的实施细则，为常州市输入性疟疾疫情的阻断筑牢政策防线。二是约谈了常州本地的几家劳务派遣公司，签订输入性疟疾防控协作协议，确保公司在派遣人员至疟疾流行区前开展一次疟疾防治知识培训，并及时提供归国人员名单，以供实时监测。培训可由常州市、区疾控中心、属地疾控中心或者保健中心进行，以便让出境人员熟悉疟疾发病的常见症状、注意防止蚊虫叮咬和及时就医。三是由保健中心对出境至疟疾流行区进行劳务、公务出差、旅游、探亲的散发体检人员进行疟疾防控知识宣传，发放防疟药物，建立人员名单，进行监测和回访。另外，2015年常州奔牛国际机场在成功建设口岸核心能力的过程中，加强了与当地相关部门的沟通，逐步建立了处理口岸传染病及公共卫生突发事件的联防联控机制。

2.3.2 联防联控政策的完善

为了及时发现输入性疟疾病例并规范处置，保持常州市疟疾消除状态，2022年8月，常州市卫生健康委联合多部门下发《常州市防止疟疾输入再传播实施方案》，进一步明确了常州市应对输入性疟疾联防联控和多部门合作的要求：（1）加强政府领导，健全管理机制。将消灭疟疾纳入地方国民经济和社会发展计划，完善领导协调机制，加强组织协调，明确责任任务，要解决突出问题，确保工作落到实处。（2）明确部门责任，加强措施落实。各有关部门要密切配合，各尽其责，共同做好消灭疟疾工作。海关以及国际旅行卫生保健中心应当具备疟疾快速诊断技术、镜检等实验室诊断能力，对前往疟疾流行区的出境人员开展疟疾防治知识宣传，必要时配合疾控机构开展输入性病例的调查与处置；卫生部门与有关部门共同制定消除疟疾的行动计划、政策和措施，并做好综合协调；公安、旅游、商务等部门应当配合卫生部门为出入境人员提供健康教育、疫情监测和疾病预防控制，并及时与卫生部门沟通相关信息。（3）服务对外企业，提高防病意识。到相关企业宣传疟疾防治知识，提供防护用品，如果条件允许，建议企业配备具有疟疾防治知识和技能的专业人员陪同。（4）加强队伍建设，提高技术水平。全市各级卫生医疗机构应保证配备疟疾防控工作的必要人员，具备相应的工作能力。定期进行检验人员镜检和疟疾快速诊断试剂检测技能培训，保证培训质量，提高业务水平。（5）建立信息通报，加强联系沟通。建立健全部门信息沟通机制，定期召开疫情分析会，突发疫情或遇有重大问题时，召开联席会议，统一协调行动。

3 常州口岸4例输入性疟疾病例处置情况回顾

3.1 概况

2014—2016年，常州口岸共检测到4例输入性疟疾，种类为恶性疟和卵形疟（表1）。病例来自金坛区和溧阳区，均为男性赴非洲务工人员，在务工当地有蚊虫叮咬史和疟疾发病史。除1例在入境后19天申报外，其余3例均在入境后3天内出现发热、发冷、出汗、肌肉酸痛等疟疾典型症状，并呈周期性发作。

3.2 处置情况

4个病例均为主动到常州国际旅行卫生保健中心进行申报被发现。保健中心进行流调后，用疟疾快速诊断试剂初步检测为疟疾阳性，并由常州市疾病预防控制中心做疟疾镜检确认分型，最后转诊至常州市第三人民医院进行治疗。所有病例均得到有效诊断和治疗，未发现二次传播或二代病例，无聚集性发病。

3.3 讨论

4个病例主要来自于农村青壮劳动力较多的金坛区和溧阳区，与常州市输入性疟疾疫情现状相符，两地区出国劳务派遣机构较为集中，每年都有较多的农民工被组织前往非洲工作，这两个地区是常州市输入性疟疾防控工作中的重点地区。经调查，4人主动申报的原因，除了因为有疟疾既往史，还因出国前在保健中心做出境体检时收到过疟疾防控知识宣传材料和抗疟物资，劳务派遣单位也开展过疟疾防控知识的宣传教育，增强了防控意识。从发现方式上来看，常州口岸发现的输入性疟疾疫情方式比较单一，均为主动申报，未形成完善的监测网络和联防联控机制，检出率比较低。此外，实验室技术人员疟疾镜检能力和经验有待进一步提高，以便对疟疾进行快速准确分型，做到及时处置病例。

4 口岸输入性疟疾防控策略探讨

4.1 提高防疟意识

世界卫生组织驻华代表高力曾提醒已被认证为无疟疾的国家，仍需保持警惕，防止疟疾死灰复燃，应持续推进本地区的疟疾防控工作。国家卫生健康委、海关总署等13个部门于2020年12月联合颁布的《防止疟疾输入再传播管理办法》，强调了疟疾防治“及时发现，精准阻传”的战略方针^[6]。特别是在新冠病毒感染防控政策调整以后，常州口岸国际航班逐渐增多，要及时通过学习宣传，全面提高常州口岸工作人员的疟疾防控意识，在多病同防的同时，加强对往返疟疾流行地区重点人群的关注，确保及早发现和处置输入性病例，防止输入后传播和本土疫情的出现。

4.2 完善监测网络

一是加强风险分析，充分利用大数据平台和海关智慧卫生检疫系统，追踪全球疟疾疫情，做好常州地区疟疾风险预警。通过分析来自非洲和东南亚的航班信息，定位重点航班和关键人群，从而更精准地发现感染人员和无症状感染者。二是实行监测网络分类，积极与当地疾控、边检、口岸经营者、劳务派遣机构、旅行社等沟通，构建归国劳务、出境劳务、出境旅行、医疗机构、入境留学等监测网络，提升输入性疟疾检出率^[7]。三是要加强宣传教育，外出务工人员文化程度普遍不高，对疟疾潜伏期感染症状不知晓，又多为分散入境，加大了监测难度。2010—2020年，常州市疟疾病例均由患者主动就医发现。需要通过宣传教育和政策鼓励，转变此类人群“生病才就医”的传统思维，归国后主动到保健中心接受疟疾筛查。

4.3 深化联防联控

口岸要加强与当地疾控、劳务派遣机构、教育、文化、旅游、公安等有关部门的联系，形成防控输入性疟疾的合力。建议常州海关和常州市疾控中心、医院共享境外感染和输入性疟疾病例信息，协同开展疟疾病例处置和调查，防止出现疟疾输入再传播。保健中心可以牵头构建常州市输入性疟疾的多部门联防联控哨点网络平台^[8]，充分利用新媒体软件，为常州地区出入境相关机构和人员提供每日疫情信息，解读政策疑问。可以建立一个评估体系，定期对劳务公司和旅行社等机构进行考核，对于宣传教育到位、及时提供归国人员名单的劳务公司，给予适当的政策优惠和便利。

4.4 干预高危人群

控制蚊虫媒介、避免蚊虫叮咬和使用预防药物是预防疟疾感染的3个主要措施^[9]，疾病控制与预防中心推荐的疟疾预防药物包括伯氨喹、氯喹和甲氟喹等^[10]，然而，尽管大多数劳务人员了解一些预防疟疾的知识，但对这些措施的实施却不到位^[11]。原因是这部分人群卫生知识和防病意识比较薄弱，或者存在侥幸心理，认为蚊虫叮咬不会感染，因此，到疟疾流行地区的境外务工人员普遍为高危人群，需要加强对此类人群的行为干预。一是创新健康教育模式，通过微信公众号、自媒体等新媒体平台普及具有娱乐性、吸引力、容易被理解和接受的疟疾防治知识，并做好境外疫情信息的更新和推送。二是加大宣传力度，强调感染疟疾可能产生的严重健康后果，破除高危人群的侥幸心理和对药物副作用的担心，引导其正确使用防蚊物资和药物，最大限度地从源头上阻断疟疾疫情的发生。

4.5 注重人才培养

无症状感染者在疟疾传播中不容忽视^[12]，已经成为消除疟疾的潜在威胁，也对口岸疟疾疫情监测工作提出了新挑战。这就需要口岸卫生检疫工作人员具备及时发现、诊断、报告输入性病例及无症状感染者的能力，从而有效阻断疟疾的输入再传播。可以定期采取网络教学、应急演练、实操实练等多种方式组织培训，增加相关专业技术人员对疟疾相关知识的储备。另外，通过联防联控机制可以委派专人参与地方卫生部门组织的疟疾培训和考核，进一步提升实验室人员镜检能力和卫生检疫人员的诊治能力。

参考文献

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基金项目：南京海关科研项目（2021KJ25）

第一作者：冯米佳（1985—），女，汉族，江苏常州人，硕士，主管技师，主要从事卫生检疫工作，E-mail: 455400680@qq.com

通信作者：杨庆贵（1977—），男，汉族，安徽肥东人，博士，主任技师，主要从事病原生物学研究，E-mail: yqg1995@126.com

1. 江苏国际旅行卫生保健中心常州分中心 常州 213022

2. 江苏国际旅行卫生保健中心（南京海关口岸门诊部） 南京 210019

1. Jiangsu International Travel Healthcare Center Changzhou Branch, Changzhou 213022

2. Jiangsu International Travel Healthcare Center (Nanjing Customs Port Clinic), Nanjing 210019

表1 2014—2016 年常州口岸检出输入性疟疾病例

Table 1 Imported malaria cases detected at Changzhou port during 2014-2016

基金项目：青岛市2022年度医药卫生科研指导项目（2022-WJZD230）

第一作者：马赛（1978—），男，汉族，河北文安人，硕士，副主任医师，主要从事出入境传染病监测工作，E-mail: ma_sai@126.com

通信作者：胡薇（1976—），女，汉族，山东济宁人，硕士，主管医师，主要从事疾病监测工作，E-mail: prettyvivian@126.com

1. 青岛海关 青岛 266071

2. 青岛市市南区卫生健康局 青岛 266071

3. 淄博市淄川区妇幼保健计划生育服务中心 淄博 255000

1. Qingdao customs, Qingdao 266071

2. Qingdao Shinan District Health Bureau, Qingdao 266071

3. Zichuan Maternal and Child Health Family Planning Services Center, Zibo 255000

Abstract This study is intended to grasp the malaria status of returnees in Shandong area from 2017 to 2022, analyze its risk factors and put forward relevant suggestions. The malaria infection data of returnees in Shandong area from 2017 to 2022 were collected and analyzed from the aspects of reasons for exit, age group, overseas residence, etc. for identification of high-risk factors, analysis of causes and development of relevant suggestions. Based on the statistics, from 2017 to 2022, there were 685 malaria cases among returnees in Shandong area, including 593 overseas labor workers and 581 young and middle-aged people, and there were 660 persons in total returning from Africa. According to the analysis, the high-risk factors of malaria infection among returnees in Shandong area from 2017 to 2022 include the overseas labor, young and middle-aged people, and travel to Africa. It is suggested to take such measures as improving consulting services for international travel health, strengthening disease surveillance for returnees, and providing more medical security to protect the health and safety of the Chinese living abroad.

Keywords Shandong; returnees; malaria infection; risk factor

疟疾是一种蚊媒传染病^[1]，由疟原虫经按蚊叮咬传播^[2]，也可以通过输入带有疟原虫的血液而感染。疟疾的临床症状主要表现为周期性寒战、发热和出汗热退^[3]，长期多次发作后可引起贫血和脾肿大。

新中国成立之前，我国4.5亿人口每年新增至少3000万例疟疾病人。即便是医疗条件逐渐改善的情况下，20世纪60—70年代我国仍然出现了2 次大范围疟疾暴发^[4]。20世纪70年代以来，随着青蒿素对疟疾治疗效果被我国医学科学家发现，疟疾在我国的发病率从较高水平下降到非常低的水平，逐步从控制阶段走向消除阶段^[5]。在不断取得疟疾控制进展成果的情况下，2010年我国提出《中国消除疟疾行动计划（2010—2020年）》。2017年，我国实现全国首次无本土原发感染疟疾病例。2020年我国实现了消除疟疾目标，并于2021年6月30日通过了世界卫生组织的消除疟疾认证^[6]。战果辉煌，得来不易。但是我们也要清醒地认识到，巩固消除疟疾成果的战役才刚刚打响。

我国每年都有大批劳务人员前往非洲、东南亚等疟疾流行区工作，而山东是我国外派劳务大省之一。近年来，山东各口岸海关卫生检疫部门、地方医疗机构、疾病预防控制机构发现部分外派劳务人员在境外感染疟疾，疟疾的输入再传播风险依然存在。巩固我国消除疟疾的战果还将是一项长期、艰巨的任务。

1 2017—2022年山东地区归国人员疟疾感染情况

1.1 2017年归国人员感染情况分析

2017年，山东地区归国人员中感染疟疾的患者共有193例，其中34 例在烟台地区，泰安地区31 例，威海地区26 例，青岛地区19 例，济宁地区13 例，临沂地区12 例，日照和潍坊地区各11 例，济南地区10 例，其他地区26 例。上述病例中，164 例为劳务人员，占84.97%；商务、公务人员各8 例，各占4.15%；旅游人员2 例，占1.04%；其他人员11 例，占5.69%。

2017年输入疟疾病例以中青年为主，其中40～49 岁患者最多，有80 例，占41.45%；30～39 岁患者58 例，占30.05%；50～59岁患者29 例，占15.03%；20～29 岁患者24 例，占12.44%；60～69 岁患者2 例，占1.03%，如图1所示。

图1 2017年山东地区归国人员疟疾病例年龄段分析

Fig.1 Analysis of age group among the malaria cases of returnees in Shandong area in 2017

据流行病学调查，患者中 189 例自非洲归国，占97.93%。其中，非洲中西部地区归国人员感染疟疾数量最高，占所有病例的62.18%（120例），主要自赤道几内亚、刚果共和国、几内亚和尼日利亚、安哥拉等地区归国。

1.2 2018年归国人员感染情况分析

2018年，山东地区归国人员发现感染疟疾患者208 例，其中29 例在烟台地区，济宁、泰安地区各26 例，青岛地区20 例，临沂地区18 例，威海地区17 例，菏泽地区15 例，潍坊地区10 例，日照地区10 例，其他地区37例。

输入疟疾患者中，劳务人员178 例，占85.58%；商务人员13 例，占6.25%；公务人员10 例，占4.81%；其他人员（含旅游、探亲）7 例，占3.36%。

输入疟疾患者仍以中青年为主，其中40～49 岁患者最多，有86 例，占41.35%；30～39 岁患者56 例，占26.92%；20～29 岁患者33 例，占15.87%；50～59 岁患者30 例，占14.42%，如图2所示。

图2 2018年山东地区归国人员疟疾病例年龄段分析

Fig.2 Analysis of age group among the malaria cases of returnees in Shandong area in 2018

据流行病学调查，患者中 206 例自非洲返回中国，占比99.04%。其中来自非洲中西部地区的患者达到126 例，占全部归国患者的60.58%，主要自尼日利亚、赤道几内亚、几内亚和安哥拉、刚果共和国等地区归国。

1.3 2019年归国人员感染情况分析

2019年，山东地区归国人员中发现感染疟疾的患者144例。其中，35例居住在济宁地区，31 例居住在临沂地区，22例居住烟台地区，威海地区21例，青岛地区14例。上述病例中，劳务人员123例，占85.42%；公务人员12例，占8.33%；旅游、商务人员各4例，各占2.78%；其他人员1例。

归国疟疾患者仍以中青年为主，其中40～49 岁64例，占44.44%；30～39 岁和50～59 岁患者均为30 例，占比均为20.83%；20～29 岁患者15 例，占10.42%。本研究阶段内，2019年首次出现10～19 岁年龄段人员，为1名前往尼日利亚旅游的学生（图3）。

图3 2019年山东地区归国人员疟疾病例年龄段分析

Fig.3 Analysis of age group among the malaria cases of returnees in Shandong area in 2019

上述144例疟疾病例中，自非洲归国人员有139 例，占比96.52%。其中，非洲中西部地区归国病例仍然最多，为113 例，占全部病例的78.47%，主要自刚果民主共和国、尼日利亚、加蓬和几内亚、科特迪瓦等地区归国。

1.4 2020年归国人员感染情况分析

2020年，山东地区归国人员中发现感染疟疾的患者明显减少，为69例，应与疫情期间出入境人员明显减少有关。其中，泰安、威海地区各11 例，青岛、临沂地区各8例，济宁、潍坊、烟台地区各5例。上述病例中，劳务人员60 例，占86.96%；公务人员5例，占7.25%；商务、其他人员各2 例，各占2.90%。

归国疟疾患者仍以中青年为主，其中40～49 岁27 例，占39.13%；30～39 岁15 例，占比21.74%；20～29 岁、50～59 岁均为12 例，各占17.39；60～69 岁3 例，占4.35%，如图4所示。

上述疟疾病例中，自非洲归国人员疟疾病例61 例，占比88.41%。其中非洲中西部地区归国病例46 例，占所有病例的66.67%，主要自刚果民主共和国、莫桑比克、塞拉利昂和加蓬、赤道几内亚、科特迪瓦等地区归国。本研究阶段内，2020年首次出现从南美洲归国病例，为1名圭亚那归国、家住烟台地区的劳务人员。

图4 2020年山东地区归国人员疟疾病例年龄段分析

Fig.4 Analysis of age group among the malaria cases of returnees in Shandong area in 2020

1.5 2021年归国人员感染情况分析

2021年，山东地区归国人员中发现感染疟疾的患者持续减少，为30 例。其中，德州地区5例，日照、泰安地区各4例，临沂、淄博地区各3例。上述病例中，劳务人员29 例，占96.67%；公务人员1例，占3.33%。

归国疟疾患者仍以中青年为主，其中40～49 岁11例，占36.67%；30～39 岁10 例，占比33.33%；50～59 岁8 例，占26.67；20～29 岁1 例，占3.33%，如图5所示。

图5 2021年山东地区归国人员疟疾病例年龄段分析

Fig.5 Analysis of age group among the malaria cases of returnees in Shandong area in 2021

上述疟疾病例中，自非洲归国人员有26 例，占86.67%。其中非洲中西部地区归国病例21例，占全部病例的70.00%，占比最大，主要自尼日利亚、几内亚、喀麦隆和刚果民主共和国等地区归国。

1.6 2022年归国人员感染情况分析

2022年，山东地区归国人员中发现感染疟疾的患者41例。其中，威海、烟台地区各7例，济宁地区5例，菏泽、临沂地区各4 例，日照、泰安地区各3例。上述病例中，劳务人员39 例，占95.12%；公务、商务人员各1 例，各占2.44%。

归国疟疾患者仍以中青年为主，其中30～39 岁13例，占比31.71%；40～49 岁12 例，占29.27%； 50～59 岁10 例，占24.39%；20～29 岁5 例，占12.20%；60～69 岁1例，占比2.43%，如图6所示。

图6 2022年山东地区归国人员疟疾病例年龄段分析

Fig.6 Analysis of age group among the malaria cases of returnees in Shandong area in 2022

上述疟疾病例中，自非洲归国病例有39例，占95.12%。其中非洲中西部地区归国病例仍然最多，达28例，占全部病例的71.79%，主要自几内亚、科特迪瓦、刚果民主共和国和安哥拉、加纳等地区归国。

2 2017—2022年山东地区归国人员境外感染疟疾高风险因素分析

2.1 工作性质因素

据分析，山东地区归国疟疾患者中，劳务人员占比居高不下，这与以下因素有关：一是劳务人员的野外工作时间较其他人员类型（如公务、商务等）明显偏长^[7]；二是卫生条件和个人防护水平较差^[7]，限于经济因素和工作生活条件，劳务人员的日常卫生条件相对较差，采取的防蚊虫等措施水平较低，对出境前国际旅行健康建议的遵从度也较低；三是劳务人员在出境人群中占比较高，基数大，患者数量也因此较高^[8]。

2.2 年龄因素

如上数据分析，30～59岁的中青年^[9]，特别是40～49岁年龄段是感染疟疾的高风险年龄段。结合工作性质因素，本研究认为其原因在于该年龄段是境外务工的主要年龄段，大多数劳务人员处于该年龄段，且该年龄段人群精力旺盛、活跃度高、活动范围大，被蚊虫叮咬和感染疟疾的风险明显高于儿童和老年人。

2.3 来自国家和地区因素

如前分析，疟疾患者主要来自非洲，与国内相关研究结果相同^[10-12]、特别是非洲中西部地区。应该针对前往非洲中西部地区的人员加大国际旅行健康咨询服务力度，促使其采取有效措施防范蚊虫、预防疟疾。

2.4 性别因素

本文未分析性别数据，因为疟疾作为一种经蚊虫叮咬传播的疾病本身并不具有明显的性别差异。但数据显示，2017—2022年山东地区归国人员感染疟疾几乎均为男性，女性患者占比极小。本研究认为其原因在于前往非洲、东南亚、南美洲等地区的出境人员以男性劳务人员为主，女性整体占比明显偏低^[13]，且女性相对而言个人防护意识更高，因此疟疾感染数量明显低于男性。

2.5 疟疾类型因素

根据收集的数据统计，2017—2022年山东地区归国疟疾病例中，患有恶性疟和卵形疟的比例明显高于间日疟和三日疟，与当地消除本土疟疾之前的流行疟疾优势种类（间日疟）不同，与许艳等^[14]的研究结果相符。

3 预防疟疾相关措施建议

3.1 加强出境前健康宣传教育

预防疟疾工作最有效的环节在于防范蚊虫叮咬，我们应该着力提高出境人员对预防疟疾、防范蚊虫叮咬的重视。因此，建议在各口岸、国际旅行卫生保健中心采取视频、展板等形式大力开展疟疾相关知识的宣传，特别是针对前往非洲地区的外派劳务人员加强出境前健康咨询、建议和教育^[15]。也可以通过微视频、微信公众号等新媒体加大宣传力度。宣传内容应从疟疾的疾病定义、感染途径、临床症状、预防措施到感染后的自我初步诊断、就医建议等进行通俗易懂的介绍，重点加强在国内相对流行较少的恶性疟、卵形疟的相关介绍，提高出境人员对疟疾的了解，促使其遵从国际旅行健康咨询医师的建议，在境外工作生活期间采取有效的防范措施。

3.2 加大归国人员疟疾监测力度

从2017—2022年疟疾感染调查情况来看，防止疟疾输入再传播工作还需敲响警钟，也提示口岸海关卫生检疫部门需要持续加强对归国人员的健康监测、特别是疟疾的监测和检测工作。目前，归国人员健康监测机制的建立和完善还存在着一定的困难，比如对归国人员健康监测的约束性和强制力还有待提升、对归国人员信息的全面实时掌握还需要进一步加强等，这都需要海关部门毫不松懈、不断探索，想方设法改变当前的不利状况，例如与地方卫生部门建立健全联防联控机制、实现信息互通共享、及时掌握归国人员信息等，切实做好归国人员的健康管理工作。

3.3 探索完善外派人员境外和归国后医疗保障机制

部分外派人员在境外感染疟疾后，因为境外高昂的治疗费用等因素而选择自行服药，甚至仅采取退热等对症治疗措施，待疾病发展到较严重程度后再归国进行规范治疗，这样不但让外派人员长期忍受病痛折磨，更有可能对疟疾患者的愈后恢复甚至身体的整体健康状况带来非常不利的影响。因此，我们应该积极探讨出境人员在境外以及归国后发病的医疗保障机制，引入商业保险等补充保障形式，为维护我国外派出境人员的生命健康安全提供基本保障。

综上所述，通过对2017—2022年山东地区归国人员感染疟疾情况进行调研、统计和分析，我们认为前往非洲，特别是非洲中西部地区的中青年劳务人员存在较高的感染疟疾风险，建议通过加强出境前健康宣传教育、加大归国人员疟疾监测力度、探索完善外派人员境外和归国后疾病医疗保障机制等措施提高外派人员预防疟疾的个人防护意识，控制疟疾的输入和再传播，保障我国外派人员境外生命健康安全。

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疟疾，俗称“打摆子”，是一种广泛流行于热带和亚热带地区的寄生虫疾病，它是通过蚊媒叮咬传播的疾病。在我国属于乙类传染病，分为间日疟、卵形疟、三日疟、恶性疟和诺氏疟，其中恶性疟危害最大。目前我国疟疾病例都来自境外输入，主要输入来源地是非洲和东南亚。我国虽不是疟疾主要流行地，但随着我国与非洲、东南亚国家间的贸易往来和旅游业发展，输入性疟疾病例在我国有不断上升的趋势。

疟疾的诊断方法有疟原虫血膜片形态镜检、抗体血清学检查或胶体金快速诊断试剂，以及PCR检测。但当虫体密度较低时（＜50个原虫/μL）^[1]，传统的镜检法易受血片制作、染色质量、染色时间、显微镜质量和检验人员镜检专业水平等因素影响。当发病初期疟原虫密度较低或因服药原因导致血液中疟原虫形态不典型时，容易发生漏判和误判。血清学抗原检测虽对设备要求低，具备快速敏感的优点，但却不能有效区分混合感染疟原虫。近年来成为主流检测方法的PCR检测技术能在短时间内很好地识别并对疟原虫分型。该技术通过体外扩增，对目标DNA或RNA在短时间内完成成百上千次的扩增，极大地提高了检测的敏感性和特异性。该方法克服了镜检漏判误判的缺陷，提高了疟疾诊断效率，对疟原虫基因进行检测具有独特优势^[2]。有文献和资料表明，18S rRNA基因是稳定的基因之一^[3]，它在细菌、植物、高等脊椎动物的某些器官、不同的发育阶段都较为稳定，因而被推广用作各种生物的体内蛋白编码基因表达水平检测的内参基因^[4-9]。目前用于疟原虫PCR检测的特异性片段一般都是检测疟原虫的基因组DNA，用一步实时荧光RT-PCR方法检测疟原虫18SrRNA是基于巢式PCR检测方法^[10]而进行的探讨性实验。

1 材料与方法

1.1 血样来源 

样品来源于广州白云机场海关在旅检口岸对有发热、寒战、皮肤丘疹症状的旅客进行全血样品采集；2% ETDA-Na₂ 抗凝。血样送到实验室后，通过镜检为阳性，储存于-80℃超低温冰箱。

1.2 主要试剂和仪器  

核酸提取试剂为上海之江生物科技股份有限公司产品，货号Z-ME-0044A；核酸检测试剂为东洋纺（上海）生物科技有限公司生产的THUNDERBIRD Probe qPCR Mix和THUNDERBIRD Probe One-step qPCR Kit。

所用仪器为上海之江生物医药科技有限公司生产的EX3600核酸自动提取仪；荧光定量PCR仪为上海之江生物医药科技有限公司生产的Mic-4实时荧光定量PCR仪；超低温冰箱为三洋公司生产的-80℃冰箱。

1.3  核酸提取

从-80℃冰箱取出全血样本，经室温解冻、混匀离心后，每个样本取300 μL加至提取反应板A行中，按核酸提取程序MVN-3.0提取，用时40 min。提取后放4℃冰箱保存。

1.4 引物与探针的设计

本研究选用的引物和探针是基于疟原虫属的18S rRNA核酸序列而设计。引物扩增的rRNA片段在疟原虫的染色体1、5、7、11和13上均重复出现。正向引物P.spp-FP: 5'-GTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAG-3'，反向引物P.spp-RP: 5'-CCAGACAAATCATATTCACGAACTA-3'。探针序列P.spp-Pro: 5' FAM- AACGGCCATGCATCACCATCCAAGAAATC-3' BHQ1。引物和探针由本实验室自行设计，由上海生物工程有限公司合成。 

1.5 一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR扩增 

THUNDERBIRD Probe One-step qPCR Kit试剂盒是通过以高效率逆转录酶ReverTra Ace为逆转录酶和以Tth DNA Polymerase为PCR酶的两酶体系进行一步法荧光定量PCR的试剂盒。主要使用TaqMan分析法进行荧光定量PCR。因为逆转录反应与PCR在同一反应体系中连续进行，反应液的分装操作一次就可以结束，可高灵敏度地检测出各种各样的RNA。  

将提取好的核酸加入MIC专用tube中，根据试剂盒说明书进行荧光定量PCR仪器参数设置。一步法实时荧光RT-PCR法步骤如下：逆转录反应温度50℃ 10 min，预变性95℃ 1 min，45个循环（95℃ 15 s，60℃ 45 s），单点荧光检测在60℃，检测通道选择FAM。反应体系为20 μL（RNase water 1 μL、2×Reaction Buffer 10 μL、DNA Polymerase 0.5 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、Primer 3 μL、RNA 模板 5 μL）上机进行扩增。

实时荧光PCR步骤如下：预变性反应温度95℃ 1 min，45个循环（95℃ 15s，60℃ 45 s），单点荧光检测在60℃，检测通道选择FAM。反应体系为20 μL（灭菌蒸馏水 2 μL、THUNDERBIRD Probe qPCR Minx 10 μL、Primer 3 μL、DNA 模板 5 μL）上机进行扩增。

1.6 重复性实验

选择一份镜检阳性血样用镜检阴性样本进行10倍倍比稀释，稀释成10^-0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。取稀释度为10^-2的阳性样本，用一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR对其重复进行7次检测，以检验方法的重复性。

1.7 灵敏度实验

将稀释度为10^-0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的样本，分别用一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR对其进行检测，每个样本重复2次，用以检测灵敏度。

1.8 临床样本检测实验

对20份疟原虫镜检阳性、5份阴性血样分别用2种扩增方法进行检测，并对检测结果进行分析。

1.9 结果判定

根据以下条件进行结果判定，疟原虫FAM通道对应的检验样本无明显扩增曲线，且未检测到Ct值，判断为疟原虫荧光PCR检测阴性；FAM通道对应的检验样本Ct值≤35，并有明显扩增曲线，判断为疟原虫荧光PCR检测阳性，应使用疟原虫种特异性引物和探针进行进一步的疟原虫种类鉴定；FAM通道对应的检验样本为35＜Ct值＜40时，标本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判断为疟原虫荧光PCR检测阳性，反之为阴性。

2 结果与分析

2.1 重复性实验

用稀释度为10^-2的样本重复7次，用一步法实时荧光RT-PCR方法均在第26个循环时起扩增曲线，曲线一致，重复性较好，如图1所示。实时荧光PCR的7次检测均有扩增曲线，但曲线较为分散，如图2所示。

图1  一步法实时荧光RT-PCR重复性检测曲线

Fig.1 One-step qRT-PCR repeatability detection curve

图2  实时荧光PCR重复性检测曲线

Fig.2 qPCR repeatability detection curve

2.2 灵敏度实验

在一步法实时荧光RT-PCR法中，第18个循环出现稀释度为10^-0的扩增曲线，最低可检测出的稀释度为10^-5，为曲线6。扩增曲线如图3所示。用实时荧光PCR在第27个循环出现稀释度为10^-0的扩增曲线，最低可检测出的稀释度为10^-2。扩增曲线如图4所示。

2.3 临床样本检测实验

一步法实时荧光RT-PCR对20份阳性样本检测，所有样本均检出为阳性，出现明显扩增曲线。最早出现扩增曲线的样本，Ct值为9.73。最后出现扩增曲线的样本，Ct值为34.22。其余样本的Ct值均在10～30以内，呈现出明显的S型扩增。5份阴性样本未检出（图5）。

1～6分别为稀释度10^-0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6扩增曲线

图3 一步法实时荧光RT-PCR 灵敏度检测曲线

Fig.3 One-step qRT-PCR sensitivity detection curve

1～3分别为稀释度10^-0、10^-1、10^-2扩增曲线

图4 实时荧光PCR灵敏度检测曲线

Fig.4 qRT-PCR sensitivity detection curve

图5  25个样本的一步法实时荧光RT-PCR检测曲线

Fig.5 One-step qRT-PCR detection curve of 25 samples

实时荧光PCR检测结果：20份阳性样本中，18份检出，有2份未检出；90%的样本出现明显扩增曲线，最早出现扩增曲线的样本，Ct值为20.89。其中，有2个样本无扩增曲线，其余样本有些虽根据Ct值判定为阳性，但Ct值在33～36之间，呈现低平且非典型的S型扩增曲线，5份阴性样本未检出（图6）。

图6  25个样本的实时荧光PCR检测曲线

Fig.6 qPCR detection curve of 25 samples

运用一步法实时荧光RT-PCR方法检测出20份全部阳性样本，检出率为100%；实时荧光PCR方法检测出18份阳性样本，检出率为90%（表1）。

表1  一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR结果比对

Table 1 Comparison of results between One-step qRT-PCR and qPCR

3 讨论

疟原虫是一种寄生虫，与病毒和细菌相比，疟原虫有着更大的基因组、多变的形态和复杂的生活史，因此对低密度检验的难度也大得多。虽然我国在2021年6月通过世卫组织消除疟疾认证，但由于人员的跨境流动，每年仍有一定数量的疟疾病例输入，并时有重症和死亡病例的发生。伴随新冠病毒感染“乙类乙管”及出入境政策的调整，境外务工、旅游人员归国返乡后，可能会导致输入性疟疾病例数的增加，若出现漏诊或误诊，会危及生命。

本研究结果显示，一步法实时荧光RT-PCR方法的重复性较好，可检出的最低稀释度比实时荧光PCR方法更低，其差值为10³。用一步法实时荧光RT-PCR方法检测的Ct值均比实时荧光PCR要小。因Ct值与模版的起始拷贝数的对数存在一定线性关系，Ct值每相差3.3，代表样本中疟原虫的浓度就相差10倍。证明选择检测疟原虫的总RNA和DNA增加了目标基因起始拷贝数。

本研究另增加了用凯杰试剂盒单独提取总RNA和DNA进行两种检测方法对比的补充实验。结果也显示：用一步法实时荧光RT-PCR方法检测RNA比实时荧光PCR方法检测DNA的Ct值更小，同一样品的Ct差别10个循环。在一步法实时荧光RT-PCR方法里添加反转录酶，增加反转录步骤^[11]，同时检测RNA和DNA，提高了检测的灵敏度，有助于检出低拷贝数的弱阳性样本。因此得出结论：一步法实时荧光RT-PCR方法检测总RNA和基因组DNA比实时荧光PCR方法的敏感性更高。

2023年4月26日是第16个“全国疟疾日”，随着国家疫情防控措施的优化调整，“一带一路”等国际交流合作将促使商业贸易回到疫情前水平，出入境航班会继续增加，疟疾防控也面临越来越大的压力。因此，推广一步法实时荧光RT-PCR这个方法可以提高对于弱阳性的样本初筛诊断准确率，做到对输入性疟疾病例早发现、早处置，尽可能避免出现重症和死亡病例，为防止该病传入国境口岸提供技术保障，确保出入境秩序平稳有序、口岸边境安全稳定^[12]。

参考文献

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[12]师永霞, 苏锦坤, 洪烨, 等. 疟疾的实时荧光PCR快速检测方法[J]. 中国卫生检验杂志, 2013, 21(3): 625-627.

第一作者：何丽润（1989—），女，汉族，广东河源人，本科，主管技师，主要从事卫生检验工作，E-mail: 335399950@qq.com 

通信作者：郑夔（1969—），男，汉族，广东湛江人，本科，主任技师，主要从事卫生检验工作，E-mail: gdiqtcp@163.com

1. 广州海关技术中心 广州 510000

1. Guangzhou Customs District Techonology Center, Guangzhou 510000

基金项目：海关总署科研项目（2021HK219），福建省科技厅科研项目（2022I0028），福州海关科研项目（FK2020-27）

第一作者：许一鸣（1991—），男，汉族，福建福州人，本科，工程师，主要从事矿产品检测工作，E-mail: crowxym@qq.com

通信作者：戴金兰（1977—），女，土家族，湖北恩施人，硕士，正高级工程师，主要从事工业品检测技术研究，E-mail: 29171239@qq.com

1. 福州海关技术中心 福州 350000

2. 天津海关工业产品安全技术中心 天津 300450

1. Fuzhou Customs Technical Centre, Fuzhou 350000

2. Tianjin Customs Industrial Product Safety Technology Center, Tianjin 300450

测量不确定度是不确定性的一种度量，是表征合理赋予被测量值的分散性，是和测量结果相联系的参数，是评定测量水平的指标，是用来判定测量结果可靠程度的依据，对检测实验室测量结果的质量评价越来越重要^[1]，ISO/IEC 17025-2017《检测和校准实验室能力的通用要求》明确规定，检测实验室应具有并应用评定测量不确定度的程序^[2]。我国是铜精矿进口和阴极铜产出大国，铜精矿中含有的砷元素直接影响到产品质量，并且能够污染环境和土壤。原国家质检总局、原环境保护部和商务部于2017年发布的《关于公布进口铜精矿中有毒有害元素限量的公告》（2017年第106号）^[3]明确规定铜精矿中砷含量不得大于0.50%。

本文按照GB/T 3884.18—2014《铜精矿化学分析方法第18部分：砷、锑、铋、铅、锌、镍、镉、钴、氧化镁、氧化钙量的测定电感耦合等离子体原子发射光谱法》^[4]，将铜精矿试料用硝酸、盐酸、氢氟酸、高氯酸溶解，在稀硝酸介质中用ICP-OES测定砷的发射强度，按照标准曲线法计算被测元素含量。根据测量不确定度的评定理论^[1,5-8]，本文研究分析了整个铜精矿中砷含量测定过程的不确定度来源^[9-10]，在数学模型中引入修正因子，简化了体积定容、称量、仪器随机波动等重复性测量的不确定度计算过程。通过推导计算，给出了扩展不确定度，并对影响铜精矿中砷含量测量不确定度的主要来源进行了分析，为ICP-OES法测量砷含量不确定度评价方法提供了参考。

1 实验部分

1.1 实验仪器

5110 VDV电感耦合等离子体发射光谱仪（美国安捷伦公司），仪器参数：提升时间15 s，读取时间5 s，稳定时间15 s，雾化器流量0.70 L/min，辅助器流量1.00 L/min，观察高度8 mm，RF功率1.20 kW，等离子体气流量12.0 L/min，砷元素光谱发射波长193.696 nm，重复次数3次。

莱伯EG37C微控数显电热板（北京莱伯泰科公司）；AG204电子分析天平（精确至0.0001 g，梅特勒-托利多集团）；BINDER烘箱ED-115；津腾水系针式过滤器（聚醚砜，13 mm×0.45 nm）；ELCA CLASSIC UVF超纯水器（英国威立雅水处理技术）。

1.2 主要试剂

1000 μg/mL砷标准储备液购于美国iNORGANIC公司；盐酸（GR）、硝酸（GR）、高氯酸（AR）均购于昆山市金城试剂有限公司。

1.3 试验步骤

铜精矿中砷含量的测定流程如图1所示。称取（0.2000±0.0010）g样品于250 mL聚四氟乙烯烧杯中，加入10 mL硝酸，于250℃加热5 min。随后加入5 mL盐酸、5 mL氢氟酸和2 mL高氯酸，350℃加热将样品完全溶解，冒高氯酸烟并使体积蒸发至1 mL，冷却至室温后加入20 mL硝酸（1+1），加热使盐类溶解，将溶液冷却至室温，并转移至100 mL的容量瓶中，用去离子水定容并摇匀，即为待测样品溶液。

配制砷标准系列工作溶液，采用ICP-OES测定其发射强度，并用线性回归法求出其校准方程，测定样品溶液中砷元素的发射强度，并由发射强度通过校准方程求出其对应浓度值，计算出结果。

图1 铜精矿中砷的测定流程

Fig.1 Determination process of arsenic in copper concentrate

2 数学模型

2.1 测量结果计算公式

根据图1测定铜精矿中砷含量的模型如公式（1）所示：

(1)

式（1）中，X为试样中砷含量（μg/mL）；C₁为工作曲线上查出的样液中砷的浓度（μg/mL）；C₀为工作曲线上查出的空白溶液中砷的浓度（μg/mL）；m为试样质量（g）；V为样液的定容体积（mL）。设定C为样液中实际砷浓度，则C＝C₁－C₀，式（1）简化为式（2）：

(2)

2.2 不确定度计算数学模型

重复测定时，样品的均匀性、前处理过程的一致性和仪器的精密度等都会对检测结果产生影响，考虑其影响量，在公式中加入修正因子，式（2）转化为式（3）：

(3)

3 不确定度来源分析

从测定过程和数学模型可以得出，影响铜精矿中的砷含量不确定度分量包括样品溶液中实际的砷含量不确定度、样品定容体积的不确定度、样品称量质量的不确定度、样品重复性分析的不确定度，具体如图2所示。

图2 ICP-OES法测定铜精矿中砷含量的不确定度主要来源

Fig.2 Main sources of the uncertainty of arsenic in copper concentrate by ICP-OES

样品溶液中砷含量的不确定度主要与标准曲线变动性的不确定度、砷标准溶液和移液枪不确定度、仪器波动性等有关。样品定容体积的不确定度与定容变动性的不确定度、定容用容量瓶体积的不确定度、定容温度与校准温度不同引起的体积变动的不确定度等有关。样品称量质量的不确定度和天平准确性和称量过程变动性有关。样品重复性分析的不确定度指同一个样品在重复条件下所进行多次测量产生的不确定度，包括了体积定容、称量、仪器随机波动等重复性测量的不确定度。

4 不确定度分量的评定

4.1 样品称量质量的不确定度

本试验中所称的质量为0.2000 g，称量不确定度来自两方面：一是称量变动性，根据提供天平出厂证书显示，其变动性标准偏差为0.0001 g，称样相对标准不确定度的计算公式为：。二是天平校准产生的不确定度，按检定证书给出的称量误差为±0.0005 g，按照均匀分布（），换算成标准偏差和相对标准偏差为0.000289 g，

。此两项合成得出称量相对标准不确定度为：

。

4.2 样品定容体积的不确定度

4.2.1 容量瓶容积的不确定度

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》和JJG 209—2010《体积管检定规程》规定^[11-14]，玻璃的校准温度在20℃时，100 mL容量瓶定容过程引入的不确定度为，根据100 mL容量瓶计量证书，100 mL容量瓶示值误差测量结果的不确定度为＝0.05 mL，容量瓶相对标准不确定度为：。

4.2.2 定容变动性的不确定度

由于定容变动性的不确定度已包含在样品重复性分析不确定度中，因而不再评定。

4.2.3 定容温度与校准温度不同引起的体积变动的不确定度u(V₃)

水溶液和容量瓶的体积会受温度变化发生膨胀或收缩，从而产生溶液体积变化的不确定度。由于水溶液体积的膨胀系数（2.1×10^-4/℃）显著大于玻璃体积膨胀系数（1×10^-5/℃），因此只考虑温度对水溶液体积的影响，而忽略温度对容量瓶本身体积的影响。标准溶液配制温度与样品溶液定容温度相差4℃（置信水平为95%），体积变化±(100×4×2.1×10^-4)＝±0.084 mL，可得不确定度为。故

mL，相对标准不确定度。

4.3 样品溶液中实际砷含量的不确定度

4.3.1 砷标准储备液的不确定度

砷标准储备液标准样品证书上注明浓度为1000 μg/mL，不确定度为1%。

4.3.2 配置标准溶液所用移液枪不确定度

以10 μg/mL为例，用梅特勒牌1 mL移液器准确移取1 mL标准溶液（1000 μg/mL）于100 mL容量瓶中，使用3%的HNO₃定容，得到10 μg/mL砷标准溶液。查询证书得移液枪移取0.1 mL、0.5 mL、1 mL溶液，不确定度为0.3%。

4.3.3 配置标准溶液所用容量瓶不确定度

同样品定容体积的不确定度故相对标准不确定度为0.000658。

4.3.4 仪器波动性不确定度

仪器波动有定向波动与随机波动两种，随机波动产生的不确定度已包括在样品重复性分析不确定度中，不再评定。如果仪器出现定向波动，则需要重新校准工作曲线或对测定结果进行校准。由于仪器一般调整至最佳工作状态且无系统偏离时进行测定，因此可将定向波动的不确定度忽略。

4.3.5 标准曲线变动性的不确定度

采用的砷标准储备液浓度为1000 μg/mL，配制成系列标准溶液，分别对系列标准溶液进行3次重复测定，结果见表1。根据表1数据，用线性最小二乘法拟合校准曲线，得回归方程为，相关系数。对样品溶液中砷含量进行3次测量，结果见表2。

表1 砷标准溶液光谱发射强度

Table 1 The spectrum emission intensity arsenic standard solution

注: 光谱发射强度单位为计数每秒 (counts per second, c/s)

表2 样品溶液3次测量结果

Table 2 Three test results of sample solution

标准曲线变动性的不确定度由式（4）所示：(4)

式（4）中，，，，， = 6.5 μg/mL（标准系列溶液的平均浓度），= 7.874 μg/mL，（标准系列每个浓度进行3次测量，共3×6＝18）。则

，

4.3.6 试剂空白中砷含量的不确定度

对空白溶液中砷含量进行3次测量，结果分别为0.0719 μg/mL，0.0721 μg/mL，0.0728 μg/mL，μg/mL。计算方法同，只需将改为，即

4.3.7 样品溶液中实际砷含量的合成标准不确定度u(C)

4.4 样品重复分析的不确定度

取同一铜矿样品重复进行6次砷含量测量，测量覆盖本方法的全过程，即从称取样品、样品的消化处理、定容、上机检测和计算结果，结果见表3。可得样品重复分析的不确定度，其相对标准不确定度为。

表3 铜精矿样品6次测量砷含量结果

Table 3 Six test results of copper concentrate samples

5 合成不确定度

对以上计算所得的相对标准不确定度进行合成，得到合成的相对标准不确定度

＝0.0473，其中各分量汇总见表4。

表4 各分量的相对标准不确定度

Table 4 Relative standard uncertainty of each component

6 扩展不确定度及结果表示

在置信概率为95%的情况下，取包含因子k＝2，则测量结果的扩展不确定度为，故本次测量结果可表示为。

7 总结

本文对测量过程进行分析，在不确定度计算模型中引入修正因子，简化了体积定容、称量、仪器随机波动等重复性测量的不确定度计算过程。

由不确定度评定过程可知，铜精矿中砷含量测量不确定度的主要来源为标准系列溶液的配置、标准工作曲线的变动性以及样品重复分析产生的不确定度。因此，在日常检测中必须准确配置标准工作溶液，检测过程中必须保持仪器的最佳工作状态，测量过程还要注意样品的平行性问题，如称样量尽可能一致、定容体积尽量缩小偏差、实验环境尽量保持一致以及适当增加样品的测试次数来剔除一些不合理的测量数据等。

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基金项目：汕头海关科技计划项目（2020STK012）

第一作者：申子晋（1988—），男，汉族，湖南邵阳人，本科，工程师，主要从事煤炭检测研究，E-mail: heipi240@126.com

1. 汕尾海关综合技术服务中心 汕尾 516600

2. 清华大学山西清洁能源研究院 太原 030000

3. 中煤平朔集团有限公司 朔州 036000

4. 太原海关技术中心 太原 030000

1. Shanwei Customs Comprehensive Technical Service Center, Shanwei 516600

2. Shanxi Research Institute for Clean Energy Tsinghua University, Taiyuan 030000

3. China Coal Pingshuo Group Co., Ltd, Shuozhou 036000

4. Taiyuan Customs Technical Center, Taiyuan 030000

Abstract A method was established for determining chlorine content in imported coal by high temperature combustion hydrolysis-automatic potentiometric titration. Automatic potential titration instrument conditions, acidity effect, titration mode, minimum addition of titration agent, identification and determination of titration endpoints were studied to obtain the best conditions for automatic potential titration. With this method to determine the chlorine in standard coal samples, the accuracy and precision are comparable to the national standard method. After the chlorine content in 4 levels coal samples was determined by eight laboratories, the data were tested by Grubbs and Cochran tests. The data agreed well with the standard value of the standard samples, and then the formulas for calculating the repeatability limit and reproducibility limit of the method were presented. The results showed that the method had the advantages of high automatization, simple operation, high accuracy and good reproducibility.

Keywords high temperature combustion hydrolysis; chlorine in coal; automatic potentiometric titration

煤炭是我国重要的进口大宗资源性商品，据海关总署2023年1月发布的统计数据显示，2022年我国进口量达2.93亿t。氯是煤中普遍存在的一种有害元素。煤中的氯含量虽然很低，但其对煤的工业利用危害很大。煤中氯多以碱金属氯化物（主要是氯化钠）的形式存在，含量一般为0.01%～0.2%，高的可达1%^[1]。煤中氯含量若超过0.3%，在用于炼焦或作燃料时会强烈腐蚀各种管道及炭化室壁^[2]，在汽化和液化过程中会产生多种有机氯化物而污染环境和危害人体健康。因此，我国《商品煤质量管理暂行办法》^[3]和SN/T 4430—2016《进口煤炭检验规程》^[4]中规定了煤中氯含量不得超过0.3%，煤中氯含量测定已作为进口煤炭品质检验的指标之一。

目前，煤中氯含量的测定主要有高温燃烧水解-电位滴定法^[5]、氧弹燃烧-电位滴定法^[6]、高温燃烧水解-离子色谱法^[7]、氧弹燃烧-离子色谱法^[8]、艾士卡试剂熔解电位滴定法^[9]等，这些方法存在自动化程度低、操作烦琐、耗时长等缺点。本研究首次引入高温燃烧水解-自动电位滴定法，采用高温燃烧水解分解煤样，将自动电位滴定仪用于氯含量的测定，仪器自动滴定、自动判断滴定终点并计算结果，该方法正确度高、重现性好，且自动化程度高、操作简便。研究结果可为海关技术执法提供检验依据，对保证进口煤的品质具有重要意义。

1 实验部分

1.1 测定原理

一定量的煤样在通有氧气和水蒸气的气流中燃烧并水解，煤中氯全部转化为氯化物并溶解于水中。吸收液全部转移至烧杯中，用硝酸酸化，以复合银电极为测量电极，以硝酸银标准溶液进行自动电位滴定测定氯含量。

1.2 仪器与试剂

仪器：高温燃烧水解-收集仪，湖南三德科技股份有限公司；905 Titrando全自动电位滴定仪，瑞士万通公司；AL104电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

试剂：硝酸（优级纯，中国国药集团有限公司）；硝酸银（优级纯，中国国药集团有限公司）；氯化钠（优级纯，中国国药集团有限公司）；煤中氯成分分析标准物质（煤炭科学技术研究院有限公司检测中心）；氧气：纯度＞99.5％；石英砂：粒度0.5～1.0 mm。

1.3 样品制备

按照相关煤样制备方法或程序 ，将样品缩制成粒度＜0.2 mm（80目）的一般分析试验煤样。

1.4 高温燃烧水解样品

准确称取一般分析试验煤样（0.50±0.01）g（称准至0.0001 g）于石英舟中，煤样上再铺盖适量石英砂，将石英舟置于通有氧气和水蒸气的燃烧管中，用推样杆推进石英舟，使其前端在300℃、600℃、800℃恒温区内各停留5 min，最后将石英舟推至1100℃恒温区停留15 min。

燃烧水解完成后，取下吸收器，停止通氧气和水蒸气；将2个吸收瓶内的液体及导气管内残留液体转移至200 mL烧杯中，加蒸馏水至（140±10） mL；用硝酸溶液（1+1）调节溶液的pH值为5，保持溶液的体积＜150 mL；向烧杯中加入1 mL硝酸（1+1）和5.00 mL氯化钠标准溶液（氯离子浓度为0.20 mg/mL），摇匀，待测。

除不加样品外，随同样品按上述步骤做空白试验。

1.5 自动电位滴定

1.5.1 测定方法

将硝酸银标准溶液[c(AgNO₃)＝0.025 mol/L]移入仪器储液瓶中，开启仪器，用该标准溶液冲洗加液器及其管路3次，并排尽管路中的气泡；将盛有待测溶液的烧杯置于滴定台上，插入搅拌装置、复合银电极及滴定头；用硝酸银标准溶液进行自动电位滴定，当电位出现最大突跃，即滴定达到等当点，仪器自动停止滴定，并计算检测结果。

一般分析试验煤样中氯（Cl_ad）的质量分数（%）按以下公式计算

(1)

式（1）中，Cl_ad为空气干燥煤样氯含量（%）；c为硝酸银标准溶液的浓度（mol/L）；V为样品溶液消耗硝酸银标准溶液的体积（mL）；V₀为空白消耗硝酸银标准溶液的体积（mL）；m为一般分析试验煤样的质量（g）；0.03545为氯的毫摩尔质量（g/mmol）。

每个样品重复测定2次，取2次测定值的平均值作为测定结果，计算结果保留至小数后3位。

2 结果与讨论

2.1 酸度的影响

硝酸银滴定溶液中的氯离子，必须控制溶液的酸度。文献和试验表明，溶液酸度为0.01～0.05 mol/L时，滴定终点电位变化较小^[5]。经试验，本方法选择在吸收液中加入1 mL硝酸溶液（1+1），可满足检测要求。

2.2 标准氯化钠溶液的加入量

用AgNO₃溶液滴定氯离子是沉淀反应，产生该沉淀反应的条件是溶液中Ag⁺和Cl^-的浓度积大于AgCl的溶度积（K_sp＝1.8×10^-10）^[10]。试验表明，煤中氯含量很低时，沉淀难以产生，直接进行自动电位滴定，或表现为结果误差较大，或滴定终点电位突跃不明显致误判终点，或找不到滴定终点。而加入一定量的标准氯化钠溶液，滴定终点电位突跃明显，可提高滴定准确度。本方法选择在待测溶液中加入5.00 mL（氯离子浓度为0.20 mg/mL）氯化钠标准溶液。

2.3 干扰元素

煤样经高温燃烧水解处理，其中的氯全部转化为氯化物随水蒸气进入冷凝器并全部溶解于水中，得到的吸收液中除Cl^-外，还含有NO₃^-、SO₄^2-、F^-、CO₃^2-、PO₄^3-等，上述离子均不干扰测定。Fe³⁺＞0.02%时，会降低终点电位的突跃^[11]，而收集的吸收液中不含Fe³⁺，因此不会对氯的测定产生干扰。

2.4 电位滴定条件的选择

2.4.1 搅拌速度

经单一变量实验验证，搅拌速度对测定结果的准确性有较大影响（表1）。若搅拌速度过快，电极响应信号波动，导致得出错误的测量值；过低的搅拌速度会造成电极处的溶液尚未混合到位，电极响应滞后，影响滴定终点。试验表明，搅拌速度控制在搅拌时产生明显的漩涡而又不产生气泡为宜。

2.4.2 滴定模式的选择

电位滴定仪滴定剂的加入模式有增量法、动态法和连续法。动态法的滴定剂加入模式是自动电位滴定仪最显著的特点，通过控制滴定溶液的加入速率，使其在电位曲线变化平缓的区域增大添加量，而在电位曲线急剧变化的区域减少添加量，以实现快速而准确的滴定。本方法选择动态滴定模式。

2.4.3 滴定剂添加量和电位变化的选择

根据试样中氯的含量，可选择5 mL或10 mL滴定管（加液器）。滴定剂的最小添加量影响滴定终点的判定，设定过小，易发生滴定开始时出现瞬时阈值过大产生毛刺峰，而被仪器误判为等当点的情况。因此，在滴定仪滴定管的最小推进量的基础上，可适当增加最小添加量或延长测量时间，选择最佳的电位变化或漂移（dE, mV）以提高滴定过程中产生电位信号变化的稳定性。

2.4.4 滴定终点的识别与确定

1）阈值的设定。电位滴定的阈值是指在判断等当点时某峰的一阶导数所必须达到的最小值，阈值设置的主要目的是消除杂峰或不正确的等当点。阈值与许多因素有关，如溶剂、浓度、传感器、反应类型等。通常建议的阈值设置是陡峭曲线一阶导数最大值的50%，平坦曲线一阶导数最大值的80%。通过试验，本方法将阈值设定为5。

2）电位突跃的范围。为了确保仪器正确判断等当点，避免仪器将滴定过程中出现的局部突跃当作滴定终点，还需选择等当点出现的范围。试验表明，等当点均出现在45 mV以后，本方法选择等当点出现的范围为45～100 mV。由于不同仪器的测量电极指示的初始电位和终了电位数值不同，所以本方法未规定电位突跃的范围，检测人员可根据需要自行选择设定。

3）终止滴定。用硝酸银滴定溶液中的氯离子，溶液中的氯离子被完全沉淀后，电位出现最大突跃，此后滴定曲线变得平稳。因此，本方法采用等当点滴定，设定等当点数为1，即当滴定达到等当点后，判为终点，仪器自动停止滴定。

综上所述，本方法选择自动电位滴定的最佳测量参数见表2。

2.5 方法的正确度试验

2.5.1 对标准煤样的测定

选择标准煤样GBW11120a，按上述方法进行试验，在相同实验条件下进行11次重复试验，其结果、平均值及标准偏差见表3。

结果表明，氯的测定值均在标准值不确定度范围内，统计量 t ＝ • /s _d ＝ 0.415 ，查表得临 界值（双侧）t_0.975,10＝2.228 ；经比较，t＜t_0.975,10 ，该法测定结果与标准样品标准值之间无显著性差异。

2.5.2 本方法与国标法的对比试验

随机选择10个煤样（煤种包括烟煤、半无烟煤和无烟煤），分别用高温燃烧水解-自动电位滴定法（以下简称电位法）和国标GB/T 3558—2014《煤中氯的测定方法》中的高温燃烧水解-电位滴定（以下简称国标法）进行氯的测定，每个样品重复测定2次，根据公式（2）、（3）、（4）计算出t 值，取2次测定值的平均值为测定结果，见表4。

(2)

(3)

(4)

公式（2）、（3）和（4）中，为测定次数；为两法测定值之差（%）；为两法测定值差值的平均值（%）；为两法测定值差值的标准偏差（%）；t为统计量。

从t 值表中查得临界值（双侧）t_0.975,10＝2.228，经比较，t＜t_0.975,10。统计结果表明，2种方法测定值均无显著性差异^[12]。

2.5.3 方法的精密度试验

共邀请8家实验室对4个水平的样品进行协同试验，其中水平1（GBW11118a，标准值0.011%±0.002%）、水平2（GBW11119a，标准值0.050%±0.004%）和水平3（GBW11120a，标准值0.111%±0.006%）样品为煤中氯元素国家标准物质，试验数据见表5。

经对参加验证的8家实验室试验数据进行柯克伦（Cochran）检验，结果表明，4个水平样品的检验统计量C值分别为0.236、0.292、0.349、0.467，均小于规定的临界值（5%的临界值C＝0.516，1%的临界值C＝0.615），无离群值。

经对参加验证的8家实验室试验数据进行格拉布斯（Grubbs）检验，结果表明：4个水平样品的检验统计量值G_P分别为1.531、1.919、0.901、1.254，G₁分别为1.117、1.493、1.872、1.786，均小于规定的临界值[5%的临界值（双侧）＝2.126，格拉布斯检验1%的临界值（双侧）＝2.274]，没有单个的歧离值和离群值。

对上述数据按照GB/T 6379.2—2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分: 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》^[13]进行统计处理，得到本方法的重复性限和再现性限计算公式。精密度见表6。

表6 煤中氯含量测定的精密度

Table 6 The precision of determination of chlorine content in coal

3 结论

本研究采用高温燃烧水解分解煤样，自动电位滴定法测定进口煤中氯含量，给出了仪器自动滴定、自动判断滴定终点的最佳条件，经与国标方法对比试验，结果的准确度与国标方法相当。8家验证实验室均认为本方法自动化程度高，操作简单快速，精密度和正确度高，8家验证实验室的验证数据与标准样品的标准值吻合度较好，通过对验证数据进行统计分析，给出了方法的重复性限和再现性限计算公式。本方法对保证进口煤的质量安全具有重要意义，也可作为其他领域测定煤中氯含量的技术参考。

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表1 搅拌速度对测定结果的影响

Table 1 Effects of the stirring speed on the determination results

表2 仪器工作参数

Table 2 Instrument working parameters

表3 标准煤样测定结果

Table 3 Determination results of standard coal samples

注: 表中氯含量的结果均为干基(Cl_d)

表4 本方法与国标法的对比试验结果

Table 4 Comparative test results of this method and the GB method

表5 煤中氯含量测定的协同试验结果

Table 5 Synergistic test results of determination of chlorine content in coal