刘立兵 周藏 付琦 孙晓霞 王金凤 钱云开 艾连峰 王建昌

Abstract In order to establish a real-time PCR method for the detection of common histamine-rich fish ingredient, the ATP-6 gene of Scomber japonicus, the BGH gene of tuna fish, the Cytb gene of saury and sardine were selected as target genes, and the specific primers and probes were designed based on the above targets. Through the optimization of reaction system, a real-time PCR assay for four histamine-rich fish ingredient was developed and the specificity and sensitivity analysis were performed. The results showed that the developed real-time PCR assay was highly specific, with no cross reactions with other common fish species. The assay also showed high sensitivity with the limit of detection for Scomber japonicus, saury, sardine and tuna fish derived ingredients of 10.0 pg/μL, 1.0 pg/μL, 1.0 pg/μL and 1.0 pg/μL, respectively. For the artificially simulated samples, the established real-time PCR assay could detect as low as of 0.1% target species in the mixed samples. Furthermore, 36 different fish products were tested by the real-time PCR assay and the detection rates were 11.11% (4/36), 5.56% (2/36), 5.56% (2/36) and 16.67% (6/36) for Scomber japonicus, saury, sardine and tuna fish ingredients, respectively. The real-time PCR assay for four common histamine-rich fish ingredient developed in this study was simple and reliable, which can provide technical supports for the import and export inspection and food safety control of fish products in China.

Keywords histamine-rich fish; real-time PCR; fish products; food safety

鱼肉肉质鲜美，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素及微量元素等，深受人们喜爱。鱼类种类繁多，主要分为海水鱼和淡水鱼两大类。高组胺鱼是指体内含有丰富的游离组氨酸，在适宜条件下，通过微生物的作用能够产生组胺的一种鱼类。常见高组胺鱼类主要是青皮红肉的海产鱼类，其体内含有丰富的蛋白质，具有很高的营养价值，但人们食用含有一定量组胺的鱼肉后，就会引起过敏性食物中毒，常被称为“组胺中毒”^[1]。研究表明，人体摄入含有80～400 mg/kg组胺的鱼肉可导致轻微的组胺中毒，摄入量超过400 mg/kg就会导致较严重的组胺中毒^[2]。我国曾多次报道关于日本鲭、秋刀鱼等高组胺鱼类引起的“组胺中毒”事件^[3-5]。但目前我国还没有建立相关的高组胺鱼类及其制品鉴别检测标准，而且在该类鱼肉制品加工与流通中，质量体系尚不健全，可能会引发因掺假使假或食品标签错误引发的食品安全问题。因此，建立一种快速、有效的检测手段对高组胺鱼类进行有效鉴别，有利于监管部门对相关企业的监督和管理，维护和保障消费者的合法权益。

鱼类物种及其制品的鉴别方法主要包括形态学法^[6]、近红外光谱法^[7-8]、变性高效液相色谱法^[9]、酶联免疫法（ELISA）^[10]、DNA条形码技术^[11-13]和实时荧光PCR方法^[14-15]。传统的形态学鉴定需要拥有良好的形态学鉴定知识，但该方法不能对加工的鱼肠、鱼罐头等鱼肉制品进行有效鉴定。近红外光谱法和变性高效液相色谱法对样品处理过程较为繁琐，仪器和试剂成本高，所以该方法在鱼类物种或其制品鉴定中应用较少。ELISA方法主要用于抗体检测，也没有商品化的鱼类鉴定的ELISA检测试剂盒，所以该方法在鱼肉制品鉴定方面研究报道较少^[16]。DNA条形码技术在物种鉴定中应用广泛，该技术利用一段较短的DNA标准序列的多态性分析，可实现未知物种快速、准确的鉴定，但该方法对高温高压、盐水浸泡、调味等处理的深加工食品进行鉴定时，由于基因组DNA受到降解或破坏，出现PCR扩增的条带较弱，甚至无扩增条带的现象，从而无法实现测序分析^[13]。

实时荧光PCR技术是利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应每一个循环产物量的变化，通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量检测，具有特异性强、操作简单、灵敏性高等特点，在肉源检测和物种真伪鉴别领域应用广泛^[17-20]。我国基于实时荧光PCR技术已经建立了黄鱼、安康鱼等鱼类制品检测的行业标准，但目前还没有日本鲭、秋刀鱼等常见高组胺鱼类的检测方法^[21-22]。本研究基于实时荧光PCR技术，设计合成日本鲭鱼、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的特异性引物和探针，建立针对4种常见高组胺鱼类成分检测的实时荧光PCR方法，实现针对4种高组胺鱼类成分的快速检测，并进一步运用所建立的实时荧光PCR方法对市售鱼肉制品进行检测，验证该方法的有效性和实用性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

日本鲭、金枪鱼、秋刀鱼、沙丁鱼、鳕鱼、罗非鱼、河豚鱼、鲤鱼、三文鱼、虹鳟、鲶鱼、蓝圆鰺等鱼肉及其制品均来自本实验室保存样品或购自国内海鲜市场。

深海鱼块、鱼排、烤鱼片、鱼肠、鱼罐头等36份鱼肉制品购自石家庄市不同农贸市场或超市。

食品基因组DNA提取试剂盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit）购自美国Promega公司；PerfectStart II Probe qPCR SuperMix（2×）购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 仪器设备

QuantStudio 5实时荧光PCR仪（美国ABI公司）；1-14台式离心机（德国Sigma公司）；NanoDrop 2000C超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；BT-20T恒温金属浴（上海本亭仪器有限公司）。

1.3 引物和探针的设计

根据GenBank上公布的物种序列，分析比对日本鲭ATP-6基因（NC_013723、AB102724.1）、金枪鱼BGH基因（NC_001960、MN954546.1、HQ425780、MG017702.1）、秋刀鱼Cytb基因（NC_003183、AY754822、AP002932）、沙丁鱼Cytb基因（MF536754.1、NC_039553.1、KY964441、DQ197990.1）序列，运用Primer Express 3.0软件在特异性区域设计引物和探针，序列见表1。所有引物和探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 样品处理和基因组DNA提取

鱼肉、鱼肠、鱼排、鱼罐头等样品用无菌水对其表面进行充分冲洗，去除油脂或腌渍等杂质，筛选出肉质部分，使用高压灭菌的无菌剪刀剪取200 mg鱼肉组织于研钵中，液氮环境下充分研磨，取50 mg肉粉于洁净的1.5 mL离心管中备用。

使用食品基因组DNA提取试剂盒对鱼肉或鱼肉制品进行基因组DNA提取，最终以100 μL无菌水溶解DNA，并用NanoDrop 2000C测定基因组的DNA浓度，将其稀释至50～100 ng/μL，放置于-20℃储存备用。

1.5 实时荧光PCR方法的建立及优化

以日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR方法的退火温度、引物和探针浓度的优化。反应体系为25 μL：2×PerfectStart II Probe qPCR SuperMix 12.5 μL，上游和下游引物终浓度分别为160 nmol/L、240 nmol/L、320 nmol/L、400 nmol/L、600 nmol/L，探针终浓度分别为160 nmol/L、240 nmol/L、320 nmol/L、400 nmol/L、600 nmol/L，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，用ddH₂O补足体系。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，退火温度分别设置55℃、58℃、60℃、63℃，退火延伸35 s，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。取不同浓度的引物和探针组合，以能给出典型的S型扩增曲线、最低Ct值和最高荧光强度值的组合为最佳退火温度和最佳引物探针浓度。

1.6 特异性试验

以提取的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼、金枪鱼、鳕鱼、罗非鱼、河豚鱼、鲤鱼、三文鱼、虹鳟、鲶鱼、蓝圆鰺的基因组DNA为模板，根据建立的最佳反应体系分别进行日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分检测，对所建立的实时荧光PCR方法的特异性进行分析。

1.7 灵敏性试验

将提取的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼基因组DNA进行10倍倍比稀释，使其浓度为1.0×10^-2～1.0×10⁴ pg/μL，以1 μL不同浓度的基因组DNA作为模板，每次试验设3个平行，对所建立的实时荧光PCR方法进行灵敏性分析。

1.8 检出限分析

将日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼鱼肉分别与鳕鱼肉按照一定质量比例混合，制成目标鱼肉含量分别为50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.01%的混合样品。提取混合鱼肉的基因组DNA，以1 μL为模板，分别进行日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分检测，每次试验设3个平行，对所建立的实时荧光PCR方法检出限进行分析。

1.9 临床样品的检测

将购买的深海鱼块、鱼排、烤鱼片、鱼肠、鱼罐头等36份鱼肉制品，按照1.4节所述方法进行处理，并进行基因组DNA提取。通过建立的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分实时荧光PCR方法进行检测，验证该方法的有效性和实用性。

2 结果与分析

2.1 实时荧光PCR方法的建立及优化结果

以实时荧光PCR方法的荧光信号最强、扩增的Ct值最小为最佳退火温度和最佳引物探针浓度。结果表明，当退火温度为60℃时，上下游引物终浓度均为400 nmol/L，探针终浓度为400 nmol/L时，所建立的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼实时荧光PCR方法荧光信号最强，扩增的Ct值最小。最佳的反应体系见表2，最佳反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸35 s，40个循环，在退火延伸时采集荧光信号。

表2 实时荧光PCR方法的最佳反应体系

Table 2 Optimal reaction system for real-time PCR methods

2.2 特异性试验

以提取的不同种类的鱼肉基因组DNA为模板，分别进行日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分实时荧光PCR方法检测。结果如图1所示，所建立的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的实时荧光PCR方法均出现单一的S形扩增曲线，而其他鱼类检测结果均无扩增曲线，表明所建立的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的实时荧光PCR方法均具有良好的特异性。

2.3 灵敏性试验

以系列稀释的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼基因组DNA为模板，分别进行实时荧光PCR方法的灵敏性分析。结果如图2所示，当日本鲭基因组DNA浓度为10 pg/μL，沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼基因组DNA浓度为1.0 pg/μL时，实时荧光PCR方法仍有典型的扩增曲线，3次重复的结果一致。结果表明，所建立的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分实时荧光PCR方法的灵敏性分别为10 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL。

2.4 检出限分析

以不同质量比例混合鱼肉的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR方法检出限分析。结果显示，当鱼肉质量比为0.1%时，可分别检测到日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分，Ct值在29.45～35.52范围之间（图3）；当鱼肉质量比为0.01%时，实时荧光PCR方法均无扩增，3次重复的结果一致。结果表明，所建立的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分实时荧光PCR方法的最低检出限均为0.1%。

2.5 实际样品检测

使用建立的实时荧光PCR检测方法，对36份鱼肉制品进行日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分检测。结果如表3所示，日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%（4/36）、5.56%（2/36）、5.56%（2/36）和16.67%（6/36）。表明所建立的实时荧光PCR方法能够对鱼肉制品中的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分进行有效检测，具有一定的实用性。

3 讨论

我国是世界水产品消费大国，随着我国人均水产品消费量逐年上升，人们对水产品安全提出了更高要求^[23]。但由于经营者缺乏专业的水产类物种分类知识，同时在经济利益驱使下，我国水产品掺假售假，甚至“组胺中毒”等事件时有发生，对人们的身心健康和合法权益造成了较大危险。

肉制品掺假一直是食品安全研究的热点之一。基于DNA检测的分子生物学方法，在肉制品掺假检测中应用广泛^[24-25]。研究表明，DNA的降解会影响扩增长度超过300 bp片段的扩增效率，所以提取到有效浓度和高质量的基因组DNA是分子生物学方法检测的前提和基础^[26]。目前，食品加工工艺较为复杂，高盐、多油等食品添加剂，以及高温、高压等加工方式都会导致DNA在一定程度上的断裂或降解，增加了样品中基因组DNA的提取难度。本研究采用无菌水对鱼肠、鱼罐头等样品进行充分冲洗，筛选出肉质部分，能够有效去除其表面的油脂或腌渍，用液氮将肉质部分研磨成肉粉，采用高效的食品基因组DNA提取试剂盒对肉粉进行提取。该方法能够获得高质量的基因组DNA，大大提高了鱼肉制品中基因组DNA的提取效率。另外，目前市场上常见的鱼肠、鱼罐头等深加工制品中通常含有多种肉类，一般提取的为多物种混合基因组DNA。检测中如果采用通用、特异性差或灵敏性低的引物探针，存在极大错检的可能性，所以选择合适的靶基因，设计特异性强、灵敏性高的引物探针对实时荧光PCR方法的建立非常重要。

实时荧光PCR方法常以不同物种间遗传信息的差异基因作为动物源性成分检测的靶点。不同物种间线粒体DNA有高度保守的特性，不受组织类别限制等优点，在动物源性成分的实时荧光PCR方法检测中被广泛应用。吴颖峰等^[27]基于线粒体色素细胞Cytb基因建立了鳄鱼源性成分的荧光定量PCR方法；李杰等^[28]根据巴沙鱼的Cytb基因建立了巴沙鱼源性成分的实时荧光PCR方法。本研究通过比对多种鱼类的线粒体基因序列，筛选种间特异的靶基因，最终根据日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因设计了针对4种常见高组胺鱼的4组引物和探针，其特异性和灵敏性能够满足实际检测的要求。但本研究建立的实时荧光PCR方法仅能对4种高组胺鱼进行定性检测，而不能进行定量检测，无法确定鱼肠、鱼罐头等鱼肉制品中高组胺鱼肉的添加量，存在一定缺陷。下一步，本课题组将加大对这4种高组胺鱼成分定量检测的研究，实现鱼肉制品中高组胺鱼肉的定量检测，从而能够有效地分析摄入的高组胺鱼肉量是否对人体有危险。

4 结论

本研究基于实时荧光PCR技术，以常见的日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼为研究对象，建立了4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。该方法特异性强、灵敏度高，最低检出限可达到0.1%。通过对36份鱼肠、鱼肉罐头等鱼肉制品的检测，结果表明能够实现鱼肠、鱼头罐头等鱼肉制品中4种高组胺鱼成分的有效检测，验证了所建立的实时荧光PCR方法的实用性。该方法为鱼肉制品中日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的检测提供了一种技术手段，能够有效提升高组胺鱼的监管和控制水平，保障消费者利益，同时也为其他鱼类物种鉴别的研究提供思路借鉴。

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表1 引物和探针序列信息

Table 1 Primer and probe sequences

1: 日本鲭鱼; 2: 沙丁鱼; 3: 秋刀鱼; 4: 金枪鱼; 5: 鳕鱼; 6: 罗非鱼; 7: 河豚鱼; 8: 鲤鱼; 9: 三文鱼; 10: 虹鳟; 11: 鲶鱼; 12: 蓝圆鰺

图1 特异性试验结果

Fig.1 Results of specificity tests

850,000

750,000

650,000

550,000

450,000

350,000

250,000

150,000

50,000

- 50,000

ΔRn

ΔRn

1,750,000

1,500,000

1,250,000

1,000,000

750,000

500,000

250,000

0

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

600,000

550,000

500,000

450,000

400,000

350,000

300,000

250,000

200,000

150,000

100,000

50,000

0

ΔRn

ΔRn

500,000

450,000

400,000

350,000

300,000

250,000

200,000

150,000

100,000

50,000

0

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

1～7：基因组DNA浓度为1.0×10⁴～1.0×10^-2 pg/μL

图2 灵敏性试验结果

Fig.2 Results of sensitivity tests

700,000

600,000

500,000

400,000

300,000

200,000

100,000

0

700,000

600,000

500,000

400,000

300,000

200,000

100,000

0

ΔRn

ΔRn

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

550,000

500,000

450,000

400,000

350,000

300,000

250,000

200,000

150,000

100,000

50,000

0

- 50,000

ΔRn

8 00,000

700,000

600,000

500,000

400,000

300,000

200,000

100,000

0

ΔRn

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ct 值

1～7质量比分别为50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.01%; 8～9: ddH₂O

图3 检出限分析结果

Fig.3 Results of the detection limit analysis

表3 实际样品的检测结果

Table 3 Detection results of the actual samples

注: “-”表示阴性

基金项目：海关总署科研项目（2022HK132）

第一作者：李志（1989—），男，侗族，贵州铜仁人，硕士，工程师，主要从事食品安全检测分析工作，E-mail: 1611458766@qq.com

通信作者：王兴宁（1981—），男，汉族，贵州毕节人，硕士，高级工程师，主要从事食品安全检测分析工作，E-mail: yunhe32785430@163.com

1. 贵阳海关综合技术中心 贵阳 550081

2. 沈阳海关技术中心 沈阳 110179

3. 沈阳农业大学 沈阳 110866

1. Guiyang Customs Comprehensive Technology Center, Guiyang 550081

2. Shenyang Customs Technology Center, Shenyang 110179

3. Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866