涂晓波 王子琳 张佳瑜 黄欣迪 牛娜 张建莹 张恒 吕敬章

Abstract A method for rapid determination of tetrahydrocannabinol in food by colloidal gold immunochromatographic assay was established. Colloidal gold was used to label tetrahydrocannabinol monoclonal antibody, and then tetrahydrocannabinol colloidal gold immunochromatographic test strip and micropore freeze-dried gold labeled antibody was developed. The sensitivity, specificity, and stability of test strip were verified. The samples of tetrahydrocannabinol in food were tested after marking and pretreating. The optimal pH value of colloidal gold, the optimal amount of antibody labeling, secondary antibody and antigen coating concentration were determined. In beverages and biscuits, the detection limit of tetrahydrocannabinol colloidal gold immunochromatographic test strip was 1 μg/mL (μg/g). The test strip had no cross-reaction with morphine, ketamine, diazepam, cocaine, phenobarbital and methadone, with good specificity. The test strip could be measured at 37℃ for 14 days with good stability. This method can quickly detect the illegally added tetrahydrocannabinol components in food, and provide theoretical and technical support for the control of illegal cannabis foods.

Keywords tetrahydrocannabinol; colloidal gold immunochromatographic assay; food

大麻类毒品是世界上吸食人群最多、销量最大、传播最广的一类毒品^[1-3]。大麻的成分极其复杂，大麻素是大麻中特有的生物活性物质，迄今已分离出100余种大麻素类化合物^[4-5]，主要包括四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（cannabidiol，CBD）、大麻酚（cannabinol，CBN）等^[6]，其中主要起致幻作用致人成瘾的精神活性物质是四氢大麻酚^[7-8]。近年来，乌拉圭、加拿大相继宣布全国范围内大麻合法化；美国有部分州允许大麻供娱乐使用、种植、生产和销售^[9-11]；加拿大、美国等国允许在饼干、饮料等食品中添加一定含量的四氢大麻酚等大麻成分^[12-15]，这些所谓的大麻食品一时间泛滥于欧美市场。

大麻在我国属于管制的毒品，从工业大麻中提取的THC不允许被添加到食品、药品和化妆品等终端中。随着经济全球化的深入，国外添加大麻的涉毒食品通过跨境电商和行邮渠道流入我国的风险日益加剧^[16]，这对防控新型毒品载体的监管能力提出了新要求，急需建立涉毒食品危害因子的监控技术，尤其是快速检测技术。

目前检测大麻成分的主要方法是气相色谱^[17]、液相色谱^[18-23]、气相色谱-质谱联用^[24-25]、液相色谱-质谱联用^[26-28]等理化检测方法，这些方法需要复杂的设备并由专业技术人员操作完成，费用昂贵。常用的初筛方法有放射免疫分析法、胶体金免疫层析技术等。放射免疫分析法灵敏度和特异性高，但仪器昂贵，因而无法实现大量普及应用。胶体金免疫层析法因具有简便快捷、结果明确、无须复杂操作、灵敏度和特异性较高等优点，非常适合对大批量样品进行快速初筛检测，而前人的研究仅建立了尿液中大麻成分的胶体金免疫层析法，本研究有助于弥补食品中大麻成分快速检测技术的空白。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四氢大麻酚（THC）标准品（纯度＞98%，德国Merck公司）；四氢大麻酚抗原-牛血清白蛋白（THC-BSA）、羊抗鼠IgG抗体、四氢大麻酚单克隆抗体（THC-mAb，杭州隆基生物技术有限公司）；碳酸钾（K₂CO₃）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、曲拉通-100（TX-100）、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、D-海藻糖、蔗糖、氯化钠（NaCl）、无水硫酸镁（MgSO₄）、甲醇（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（超纯级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；盐酸（HCl）（浓度37%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；吗啡、氯胺酮、地西泮、可卡因、苯巴比妥、美沙酮标准工作液（深圳海关食品检验检疫技术中心理化实验室）。

CN95硝酸纤维素膜（深圳市百穗康实业有限公司）、Z90样品垫（通晟福州纸业有限公司）、AN3吸水纸（杭州布陆斯贸易有限公司）。

1.2 仪器与设备

TGL-16M高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；90-2数显恒温磁力搅拌器（金坛区西城新瑞仪器厂）；BSA124S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；pH-103 pH测试笔（常州爱德克斯仪器仪表有限公司）；LGJ-20FXD冻干机（河南兄弟仪器设备有限公司）；HM3030 XYZ三维划膜喷金仪器（上海金标生物科技有限公司）；DHG-9140A 鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；ZQ2002微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）；ZXDP-A2080电热恒温箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；SB25-12 DTD超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MS3B涡旋振荡仪（德国IKA公司）；Turbo Vap LV浓缩氮吹仪（瑞士Biotage公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 金标抗体的制备

按照FRENS^[29]的方法制备胶体金后，分别移取1 mL胶体金溶液，加入适量体积的0.2 mol/L K₂CO₃溶液，快速涡旋混匀，加入适量体积THC抗体，常温静置15 min，加入100 μL10% NaCl溶液，常温静置15 min。选择无变色胶体金溶液，加入100 μL 10% BSA溶液，常温静置15 min后，11000 r/min、4℃离心10 min，弃上清，用100 μL pH为8.0的0.01 mol/L Tris-HCl（含10%海藻糖、5%蔗糖、1% BSA）复溶，得到胶体金探针溶液，4℃冷藏备用。本研究通过下列试验确定抗体标记胶体金的最适pH值和抗体标记量。

（1）抗体标记胶体金最适pH值的确定。将1 mL胶体金溶液置于离心管中，分别加入6 μL、8 μL、10 μL、12 μL 0.2 mol/L K₂CO₃溶液，其他条件同上。加入5 μg THC单克隆抗体，常温静置15 min，加入100 μL 10% NaCl溶液，常温静置15 min。另设立一组胶体金溶液作为颜色对照管，观察静置后胶体金溶液颜色变化，与对照管胶体金溶液颜色接近的pH值即为最适值。

（2） 抗体标记胶体金最适抗体标记量的确定。将1 mL胶体金溶液置于离心管中，加入8 μL 0.2 mol/L K₂CO₃溶液，涡旋混匀。分别加入5 μg、10 μg、15 μg THC单克隆抗体，常温静置15 min，加入100 μL 10% NaCl溶液，常温静置15 min。另设立一组胶体金溶液作为颜色对照管。观察静置后胶体金溶液颜色变化，与对照管胶体金溶液颜色接近的标记量值即为最适抗体标记量。

1.3.2 冻干微孔试剂的制备

将100 μL抗体标记胶体金溶液加入至微孔板中，置于真空冷冻干燥机，冷阱温度-45℃，预冻时间2.5 h，真空冷冻干燥时间18 h，即得THC单克隆抗体标记胶体金冻干的微孔试剂，4℃储存备用。

1.3.3 试纸条制备与组装

用pH为7.2的PB溶液将羊抗鼠二抗溶液稀释至0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL，用1% BSA溶液将THC抗原稀释至0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL。将二抗溶液和抗原溶液用XYZ三维划膜喷金仪器以0.8 μL/cm的速度划至NC膜上，分别作为C线和T线（相距8 mm），置于37℃烘干2 h。如图1所示，将烘干后的NC膜粘贴于PVC底板上，分别将吸水纸和样品垫粘贴于NC膜的上方和下方，二者均与NC膜重叠约3 mm。将组装好的卡板放于微电脑自动斩切机中，切成4 mm宽试纸条。将试纸条装入干燥筒中，常温储存备用。

图1 四氢大麻酚胶体金免疫层析试纸条示意图

Fig.1 Schematic illustration of THC colloidal gold immunochromatographic test strip

1.3.4 胶体金免疫层析试纸条灵敏度

用含有10% TX-100的0.01 mol/L PBS溶液（pH = 7.4）层析液配制0～1000 ng/mL THC标准工作液。取200 μL溶液加至含金标抗体冻干的微孔，吹打复溶后进行试纸条检测。反应5～10 min后观察，当T线颜色淡于C线时，该浓度即为试纸条的检出限。

1.3.5 试纸条的特异性

测试吗啡、氯胺酮、地西泮、可卡因、苯巴比妥、美沙酮禁用毒品与THC试纸条的交叉反应，观察T线和C线显色，测试试纸条的特异性。

1.3.6 加速稳定性

将THC试纸条和包被有金标抗体冻干的微孔板于37℃下分别放置0 d、7 d、14 d，测试不同加速时间内试纸条和金标抗体冻干物对检出限浓度THC工作液的检测加速稳定性。

1.3.7 试纸条的准确性

取30份空白饮料、饼干样品制作THC添加样品（检测浓度分别为＜1 μg/g和≥1 μg/g），另取10份空白饮料、饼干样品制作空白样，使用试纸条检测的同时，根据唐庆强等^[30]建立的基于液相色谱-串联质谱法测定食品中THC的方法，使用液相色谱串联质谱仪对样品进行检测，并对比2种方法的检测结果，计算假阴性率和假阳性率。

1.3.8 样品前处理方法

移取1 mL样品，加入不同体积甲醇或乙腈，涡旋混匀，加入不同克数NaCl，40℃超声20 min，8000 r/min离心5 min。取部分上清液，加入不同体积正庚烷、正己烷或硫酸镁-氯化钠进行样液净化，振荡5 min，8000 r/min离心5 min。取1 mL上清液，40℃氮吹至近干，使用1.3.4步骤中层析液定容至0.5 mL。取定容后液体过0.22 μm有机尼龙膜，饼干样液在过膜前-20℃冷冻20  min，待测。

2 结果与分析

2.1 实验原理

THC胶体金免疫层析试纸条应用了胶体金竞争性免疫抑制原理。待测溶液和金标抗体在NC膜上层析时，若待测溶液中无目标物质，则金标抗体与T线上包被的THC-BSA偶联物特异性结合，使得T线显色。剩余金标抗体则继续层析，与C线包被的羊抗鼠IgG结合，C线显色，此时为阴性结果；若待测溶液中含有目标物质，则目标物质和金标抗体竞争结合THC-BSA偶联物，此时T线显色浅于C线，即为阳性结果；若C线不显色，即为无效结果（图2）。

2.2 抗体标记条件的确定

通过在胶体金溶液中加入不同体积0.2 mol/L K₂CO₃溶液确定抗体最适pH值，之后加入不同体积THC单克隆抗体确定最适抗体标记量。如表1和表2所示，与对照管颜色相比，随着胶体金溶液pH值增大及THC单克隆抗体标记量增加，当pH = 6、抗体标记量为5 μg时，胶体金溶液颜色与对照管颜色一致。在实际应用中，最适抗体标记量需要在最低稳定抗体量的基础上增加20%。因此，THC抗体标记最适pH值为7.2，最适抗体标记量为6 μg。

表1 抗体标记最适pH

Table 1 The optimal pH of antibody labeling

2.3 二抗及抗原最佳包被浓度及检出限的确定

C、T线分别设置0.5～2 mg/mL及0.25～2 mg/mL包被浓度，在不同THC标准工作液浓度下，测试达到最低检出限时二抗及抗原的最佳包被浓度（图3），最终结果显示，当抗原浓度0.5 mg/mL、二抗浓度0.5 mg/mL、THC标准工作液浓度1000 ng/mL时，T线颜色浅于C线，结果为阳性。因此，THC胶体金免疫层析检测试纸条的检出限为1000 ng/mL。

二抗 (C线) 包被浓度为0.5 mg/mL, 抗原 (T线) 包被浓度为0.5 mg/mL

图3 试纸条检出限测试

Fig.3 Detection limit test of test strip

2.4 试纸条的特异性

分别配制浓度为1000 ng/mL的吗啡、氯胺酮、地西泮、可卡因、苯巴比妥、美沙酮标准工作液，添加至包被由冻干金标抗体的微孔内，混合均匀后插入试纸条检测。结果显示，试纸条对这些毒品的检测结果均为阴性，提示THC胶体金免疫层析试纸条特异性良好，与其他毒品无交叉反应。

2.5 加速稳定性分析

根据1.3.6步骤进行加速稳定性分析，测试1000 ng/mL THC工作液的检出情况。结果如图4所示，当试纸条和微孔冻干金标抗体在37℃下分别放置0 d、7 d、14 d后，试纸条对THC工作液的检出结果没有变化，空白液和THC工作液的检测结果正常，说明试纸条和微孔冻干金标抗体的加速稳定性良好。加速14 d后，试纸条检测会出现少量假阳性结果，可在层析液中添加少量甲醇提高对T线的浸润性。

图4 试纸条加速稳定性

Fig.4 Accelerated stability of test strip

2.6 试纸条准确性

使用胶体金试纸条检测和液相色谱-串联质谱仪检测结果见表3，在10个空白样本中，2种检测结果均为未检出，在10个THC浓度＜1 μg/g的样本中，试纸条检测结果均为阴性，故假阳性率为0%。在20个THC浓度≥1 μg/g的样本中，试纸条检测结果均为阳性，故假阴性率为0%。

2.7 空白添加样品检测结果

空白样品选取常见的进口饮料（气泡水、椰子水、咖啡）及饼干。饮料样品THC添加浓度为2 μg/mL，加标后混合均匀；饼干匀质样品THC添加浓度为3.5 μg/g，加标后静置10 min。加标完成后按1.3.8步骤进行前处理。另设置阴性对照组和阳性对照组。试验结果显示，对比甲醇和乙腈的提取效果，二者均可提取样本中的盐类、糖类等物质，导致胶体金颗粒外面的水化层被破坏，胶体金出现聚沉、变色。在增加净化步骤后，对比不同净化方法，正庚烷和正己烷均能净化样液，使得试纸条检测结果为有效（C线正常显色），但回收率不佳导致未能检出THC。使用硫酸镁-氯化钠进行净化，饮料和饼干空白加标样液检测均呈阳性，检出限为1 μg/g，对照样液均呈阴性，结果提示使用盐析法净化效果最佳。最终确定1 mL/1 g饮料和饼干样本分别使用3 mL、7 mL甲醇提取，1 g MgSO₄和0.23 g NaCl、2 g MgSO₄和0.46 g NaCl净化。

检测结果如图5所示，与对照组相比，饮料和饼干加标样本均显阳性。结果表明，该试纸条可有效应用于饮料和饼干食品基质中的THC含量。

3 结论

本研究在探索样品前处理条件时发现，提取试剂的选择以及后续前处理操作对胶体金免疫层析检测体系的影响较大。使用甲醇提取时，样品中残余盐类和糖类物质较多，导致胶体金颗粒外面的水化层被破坏而出现聚沉、变色现象，净化选用盐析法可达到满意效果。为了实现现场大批量快速检测，后续研究中需要继续优化试验步骤以缩短检测时长，提高可操作性。

本研究建立了快速检测饮料和饼干中非法添加四氢大麻酚的胶体金免疫层析法，对胶体金最适pH值、金标抗体最适标记量、二抗及抗原包被浓度、试纸条的检出限及特异性、加速稳定性、样品前处理等实验条件进行了探索和优化。该四氢大麻酚检测试纸条的检出限为1 μg/g，特异性良好，稳定性佳，5～10 min即可读取结果。在一些大麻食品合法化国家中，大麻添加食品中THC含量较高（2～10 μg/g）^[31]。本研究建立的胶体金免疫层析法的检出限为1 μg/g，可满足多数食品基质的快速检测，为基层现场快速检测食品中四氢大麻酚提供有力的理论和技术支撑。

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图2 胶体金免疫层析试纸条检测结果判读

Fig.2 Result determination of colloidal gold

immunochromatographic test strip

表2 最适抗体标记量

Table 2 The optimal labeling amount of antibody

表3 四氢大麻酚快速检测试纸条与液相色谱-串联质谱仪检测结果对比

Table 3 Results comparison of tetrahydrocannabinol rapid test strip and liquid chromatograph-tandem mass spectrometry

注: “-”代表阴性, 待测物含量低于检出限1 μg/g; “+”代表阳性。

图5 椰子水和饼干空白添加样品胶体金免疫层析检测结果

Fig.5 Colloidal gold immunochromatographic test results of blank spiked samples of coconut water and biscuits

基金项目：甘肃省科技计划项目( 20JR5RA380 )

第一作者：解迎双（1985—），女，汉族，甘肃兰州人，硕士，高级工程师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: 173355905@qq.com

通信作者：王溪桥（1982—），男，汉族，甘肃兰州人，硕士，高级农艺师，主要从事食品安全及种子检测工作，E-mail: brooksu37@163.com

1. 兰州海关技术中心 兰州 730010

2. 白银市市场监管局 白银 730900

1. Lanzhou Customs Technology Center, Lanzhou 730010

2. Baiyin's Market regulator, Baiyin 730900